文章解讀：Tiger

文章校對(duì)：生信寶典

研究背景

基質(zhì)細(xì)胞是幾乎每個(gè)器官中都存在的定義不明確的非實(shí)質(zhì)成分，在器官發(fā)育，體內(nèi)平衡和修復(fù)中起關(guān)鍵作用。對(duì)骨髓基質(zhì)的研究已經(jīng)確定了干細(xì)胞生態(tài)位中的基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞亞型，其調(diào)節(jié)造血再生并且能夠引發(fā)白血病。在這里，我們使用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）來(lái)定義小鼠骨髓基質(zhì)的細(xì)胞分類和由惡性腫瘤引起的基質(zhì)變化。我們鑒定了17個(gè)表達(dá)不同造血調(diào)節(jié)基因的基質(zhì)亞群，包括新的成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞亞群，構(gòu)建了不同的成骨細(xì)胞分化軌跡。新發(fā)的急性髓性白血病損害了間充質(zhì)成骨分化并導(dǎo)致正常造血所必需的調(diào)節(jié)分子減少。這些數(shù)據(jù)表明，組織基質(zhì)通過(guò)干擾正常實(shí)質(zhì)細(xì)胞而對(duì)惡性細(xì)胞發(fā)起響應(yīng)。我們對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的分類進(jìn)行了全面解析，也發(fā)現(xiàn)了特定基質(zhì)細(xì)胞可以與癌細(xì)胞進(jìn)行互作進(jìn)而損害正常組織。

研究方案

Sample: 非造血的骨髓細(xì)胞，分別取C57BL/6 mice, leukemic mice (造模)（很有趣的是我正文沒有看見細(xì)胞數(shù)！）

單細(xì)胞建庫(kù)流程：典型10X Genomics（如下圖）

測(cè)序數(shù)據(jù)分析介紹

工具: Chromium Single Cell 3’ V2 Reagent Kit;

比對(duì): Mouse genome, version mm10；excluded cells with fewer than 500 detected genes;

降維：Seurat package， 表達(dá)矩陣→歸一化→挑選高變化表達(dá)的基因 （剔除cell-cycle，ribosomal protein,and mitochondrial genes）→PCA分析→使用top 50 (elbow算法) PCA進(jìn)行細(xì)胞分群；

細(xì)胞分群和展示：graph cluster+t-SNE;

增殖狀態(tài)的評(píng)估：作者引用一篇文獻(xiàn) (Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells. Genome Res. 25, 1860–1872.)中涉及cell-cycle的gene set，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中這些基因的平均表達(dá) (transcripts per 10K transcripts)作為增殖狀態(tài)的表示；

GSEA分析；一文掌握GSEA，超詳細(xì)教程

隨機(jī)森林分類器：訓(xùn)練隨機(jī)森林分類器，預(yù)測(cè)cluster;

結(jié)果分析

(1) 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的scRNA-Seq識(shí)別六種不同的細(xì)胞群及其分化關(guān)系;作者對(duì)14只C57BL/6小鼠的非造血骨髓細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序；分別為：1）多能間充質(zhì)干細(xì)胞 （MSC）（cluster1，表達(dá)Lepr）和Cxcl12; 2) 兩個(gè)骨系細(xì)胞（OLC）亞群（cluster7和8，表達(dá)骨鈣素[Bglap]）；3）四個(gè)軟骨細(xì)胞亞群（cluster2,10,13和17;表達(dá)軟骨細(xì)胞標(biāo)記物，聚集蛋白聚糖[Acan]）和Col2a1; 4）5個(gè)成纖維細(xì)胞亞群（cluster3,5,9,15和16;表達(dá)成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1 [S100a4]）; 5）三個(gè)骨髓派生的內(nèi)皮細(xì)胞BMEC子集（cluster0,6和11;表達(dá)泛內(nèi)皮標(biāo)記Ve-cadherin [Cdh5]）;6）周細(xì)胞（cluster12，表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白[Acta2]）; 7）cluster4和8，表達(dá)軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的標(biāo)記。流式分選MSC和BMEC，標(biāo)記BMEC（CD31，Sca-1（Ly6a），CD34，Cdh5）或MSC（CD106）。

(2) Lepr-MSCs通過(guò)產(chǎn)生HSC調(diào)節(jié)因子跨越連續(xù)分化狀態(tài)并分成細(xì)胞亞群；骨髓中MSCs的主流模型是多能干細(xì)胞，可分化為骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，但它們的確切身份仍不清楚。作者將cluster1定義為具有前脂肪細(xì)胞特征的Lepr +間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（Lepr-MSC）。作者定義該細(xì)胞亞群的重要身份是通過(guò)其他細(xì)胞的特異性marker在該種細(xì)胞的泛表達(dá)。在Lepr-MSCs中，作者區(qū)分了四個(gè)主要子集（LeprMSC-1-4），一個(gè)子集（Lepr-MSC-4）具有OLC特異性關(guān)鍵功能基因Sp7（osterix）和Alpl的表達(dá)，表明其正向成骨細(xì)胞進(jìn)行分化，也支持了Lepr-MSC和OLC-1在分化軌跡方面的連續(xù)轉(zhuǎn)化。

(3) 推斷的譜系關(guān)系表明兩個(gè)不同分OLC亞群的不同起源和不同的造血支持潛力 (Hematopoietic Support Potential);為了進(jìn)一步的分析骨系分化，作者將重點(diǎn)放在了Lepr-MSC-4，OLC-1,OLC-2 3個(gè)細(xì)胞群。三個(gè)clusters都可以表達(dá)控制MSCs向OLCs分化的重要轉(zhuǎn)錄因子Runx2；OLC-1,OLC-2 進(jìn)一步表達(dá)Sp7，都是骨譜系分化的重要因子；然后作者發(fā)現(xiàn)OLC-1cluster在成骨細(xì)胞狀態(tài)中存在連續(xù)性，并且作者發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)序下gene 表達(dá)情況不同；作者在OLC-2 cluster（幾乎均為bone orgin）中觀察到其有3種類型細(xì)胞組成，包括骨祖細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；但只有OLC-1細(xì)胞表達(dá)造血調(diào)控因子，說(shuō)明兩種OLC不同的分化來(lái)源和不同的造血潛能。

(4) 后緒作者分別對(duì)軟骨細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞，BMEC和周細(xì)胞分別進(jìn)行了分類；發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞的某些亞群可以調(diào)控造血系統(tǒng)；

(5) 白血病中小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞比例發(fā)生重塑；作者檢測(cè)到白血病細(xì)胞亞群比例的顯著變化，并且呈現(xiàn)的是一種“coupled effect”，其中（OLC-1增加，OLC-2減少），BMECs（sBMEC減少，cluster6 aBMEC增加），軟骨細(xì)胞（cluster2增加，cluster4減少）和成纖維細(xì)胞（成纖維細(xì)胞-5s減少，成纖維細(xì)胞-2s增加）；該種shift與之前的報(bào)道是相同的，在白血病患者中可以發(fā)生血管重塑，并且損傷骨形成，生長(zhǎng)缺陷。

(6) 白血病在Lepr-MSCs和OLCs中損傷了成骨和成脂的分化途徑并且白血病廣泛的損傷了正常造血系統(tǒng)的調(diào)控基因的表達(dá)；

臨床意義

（1）基質(zhì)細(xì)胞分型可以更清晰，更一致地定義特定基質(zhì)細(xì)胞對(duì)體內(nèi)平衡和異常造血功能的影響，并為血液系統(tǒng)疾病中的基質(zhì)靶向治療奠定基礎(chǔ)；

（2）為腫瘤進(jìn)化提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，其中實(shí)質(zhì)和基質(zhì)元素之間的交叉通信可能影響癌癥的出現(xiàn)。

單細(xì)胞文章點(diǎn)評(píng)

該篇文章的亮點(diǎn)在于利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)骨髓中的stroma進(jìn)行分類并對(duì)其在正常機(jī)體和白血病中所發(fā)揮的作用進(jìn)行闡釋；

但是，這篇文章所利用的單細(xì)胞的分析方法幾乎是最為簡(jiǎn)單的分析流程，并且作者并不強(qiáng)調(diào)其測(cè)序細(xì)胞數(shù)的多少（圖例中的細(xì)胞數(shù)嚇?biāo)廊?#xff09;，在software中幾乎只用到了seurat和Scanpy；

其實(shí)看到這篇文章的第一反應(yīng)，是我想到了另外一篇文章，***Nature*于2019.05發(fā)表的文章《The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.》**該篇文章對(duì)骨髓中的成骨細(xì)胞，血管細(xì)胞等在正常和應(yīng)激情況下進(jìn)行比較分析；

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)最近有關(guān)基質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性的單細(xì)胞文獻(xiàn)也是比較多的，這可能與先期實(shí)驗(yàn)捕獲有關(guān)，上皮細(xì)胞的捕獲數(shù)量往往沒有基質(zhì)細(xì)胞多，也由于基質(zhì)細(xì)胞幾乎無(wú)處不在，作用在傳統(tǒng)意義上有許多的未知；（建議如果你的臟器當(dāng)中主成分是上皮細(xì)胞的話，不要按照流程處理，去看看文獻(xiàn)；如果你做的是全臟器的單細(xì)胞圖譜，建議先取胰腺）

我更想說(shuō)的是，這是一篇標(biāo)準(zhǔn)的單細(xì)胞圖譜的構(gòu)建過(guò)程，其實(shí)有一點(diǎn)懷疑這篇文章發(fā)到***Cell***的亮點(diǎn)在哪里，看來(lái)圖譜類的單細(xì)胞還沒有做完吧。。。

這篇文章描述的很細(xì)致，這也是單細(xì)胞文章的特點(diǎn)吧。分析部分分完群后更多的是定制性你選擇關(guān)注的信息，進(jìn)行針對(duì)性描述。

自己會(huì)分析還是比較關(guān)鍵的，不然看到有意義的結(jié)果都不能下手去篩選。

參考文獻(xiàn)

Baryawno N, Przybylski D, Kowalczyk MS, Kfoury Y, Severe N, Gustafsson K,Kokkaliaris KD, Mercier F, Tabaka M, Hofree M, Dionne D, Papazian A, Lee D,Ashenberg O, Subramanian A, Vaishnav ED, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, Scadden DT.A Cellular Taxonomy of the Bone Marrow Stroma in Homeostasis and Leukemia. Cell. 2019 May 9. pii: S0092-8674(19)30459-3. doi: 10.1016

文末彩蛋

哈哈哈，就是解析**Nature這篇于2019.05發(fā)表的文章《The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.》

研究背景

骨髓微環(huán)境在調(diào)節(jié)造血功能中具有關(guān)鍵作用，但其分子復(fù)雜性和對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)尚未完全了解。作者通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序在體內(nèi)平衡和應(yīng)激誘導(dǎo)的造血條件下繪制小鼠骨髓血管，血管周圍和成骨細(xì)胞群的轉(zhuǎn)錄圖譜。該分析揭示了骨髓生態(tài)位中先前未被認(rèn)可的細(xì)胞異質(zhì)性水平和解決了造血生長(zhǎng)因子、趨化因子和膜結(jié)合配體的細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題。研究表明，在應(yīng)激條件下，生態(tài)位元素的轉(zhuǎn)錄重塑，包括血管周圍細(xì)胞向脂肪細(xì)胞發(fā)展。在應(yīng)激誘導(dǎo)的變化中，我們觀察到血管Notch delta樣配體（由Dll1和Dll4編碼）被下調(diào)。在沒有血管Dll4的情況下，造血干細(xì)胞過(guò)早地誘導(dǎo)了髓樣轉(zhuǎn)錄程序。這些發(fā)現(xiàn)改進(jìn)了我們對(duì)骨髓生態(tài)位細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理解，揭示了對(duì)應(yīng)激高度敏感的動(dòng)態(tài)和異質(zhì)分子圖譜，并說(shuō)明了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在評(píng)估離散生態(tài)亞群對(duì)造血功能的調(diào)節(jié)中的效用。

研究方案

Sample:一共17374個(gè)細(xì)胞，共構(gòu)建了三種敲入reporter的小鼠進(jìn)行標(biāo)記，VE-Cad–tdTo-mato標(biāo)記脈管類細(xì)胞、LEPR–tdTomato標(biāo)記LEPR+陽(yáng)性的細(xì)胞、COL2.3–tdTomato 標(biāo)記成骨細(xì)胞 ；

單細(xì)胞建庫(kù)流程：應(yīng)用的是SMARTA-seq,建庫(kù)流程如下：

測(cè)序數(shù)據(jù)分析介紹

工具:SMART-seq v4 ;

比對(duì)?genome (mm10/GRCm38)using STAR alinger;少于1000個(gè)gene的細(xì)胞，2%離群細(xì)胞被剔除；

降維：Seurat package， 先通過(guò)CCA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，表達(dá)矩陣→歸一化→PCA分析，top40 PCA用于后續(xù)分析;

細(xì)胞分類和展示：tSNE;

構(gòu)建細(xì)胞發(fā)育軌跡：Monocle package;

結(jié)果展示

臨床意義

1.將造血因子與其細(xì)胞來(lái)源相匹配，并顯示血管 - 內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的Notch配體DLL4的缺失使骨髓造血傾向于HSPC的顯著轉(zhuǎn)錄重編程；

2.靶向生態(tài)位相關(guān)因子可能干擾疾病的發(fā)生和發(fā)展;

有興趣的就去讀全文吧！

參考文獻(xiàn)

Tikhonova AN, Dolgalev I, Hu H, Sivaraj KK, Hoxha E, Cuesta-Domínguez á, PinhoS, AkhmetzyanovaI, Gao J, Witkowski M, Guillamot M, Gutkin MC, Zhang Y, MarierC, Diefenbach C, Kousteni S, Heguy A, Zhong H, Fooksman DR, Butler JM, Economides A, Frenette PS, Adams RH, Satija R, Tsirigos A, Aifantis I. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019 May;569(7755):222-228.doi: 10.1038

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的骨髓基质在正常和白血病个体中的细胞图谱|Cell最新（文末有彩蛋）的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。