臍帶血單個(gè)核細(xì)胞:是指臍帶血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，目前臍帶血單個(gè)核細(xì)胞主要的分離方法是Ficoll密度梯度離心法。

密度梯度離心原理:利用不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶，根據(jù)血液中各成分比重的不同:紅細(xì)胞>中性粒細(xì)胞>淋巴細(xì)胞>單核細(xì)胞>血漿(包括血小板)，用Ficoll外周血淋巴細(xì)胞分離液(相對(duì)密度為1.077±0.001，介于中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞之間)將臍血細(xì)胞分成不同的層次。

“如期生物”臍血單個(gè)核細(xì)胞科研產(chǎn)品優(yōu)勢(shì):

“如期生物”臍血單個(gè)核細(xì)胞取自健康足月分娩孕婦的臍帶血分離制備而成;

“如期生物”生產(chǎn)產(chǎn)品經(jīng)過(guò)嚴(yán)格制備、檢測(cè)環(huán)節(jié)，每一份產(chǎn)品均有獨(dú)立的檢測(cè)報(bào)告。保證產(chǎn)品高質(zhì)量的

同時(shí)確保產(chǎn)品血液傳染病檢測(cè)均合格，避免操作人員因操作不慎導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)。

警告：產(chǎn)品僅供科研使用，嚴(yán)禁用于臨床治療和其他用途使用！

操作原則:

1.要在無(wú)菌條件下，如生物安全柜或潔凈工作臺(tái)處理該產(chǎn)品;

2.操作人員在操作過(guò)程中注意穿戴防護(hù)服;

3.我們建議細(xì)胞的接種密度為25-4.0x104cells/cm2，具體數(shù)量請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)加以調(diào)整。

復(fù)蘇和培養(yǎng):

臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng):

1.準(zhǔn)備好37℃水浴。

2.準(zhǔn)備好人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，溫育到37℃。

3.在15 mL離心管中加入9 mL的人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。

4.從液氧罐口取出凍存的人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞，立即放入-80℃冰箱(目的是讓進(jìn)入凍存管的液氮稍加揮發(fā))。

5.在-80℃放置2-3 min后，取出凍存細(xì)胞，將凍存管迅速放入37℃溫水中，快速晃動(dòng)使管中內(nèi)含物盡快融化。仔細(xì)觀(guān)察，待凍存管內(nèi)含物完全融化后取出。

6.用70%-75%酒精消毒凍存管口的外壁。

7.在超凈臺(tái)中打開(kāi)凍存管，用吸管將細(xì)胞凍存懸液移入裝有9 mL完全培養(yǎng)基的15mL離心管中。在這一過(guò)程請(qǐng)盡可能避免產(chǎn)生氣泡。

傳代:

臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的傳代:

1.將人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、PBS、0.25%EDTA預(yù)熱至37℃。。 2.吸去培養(yǎng)液。

3.用PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3 mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6 mL)洗滌細(xì)胞2-3次。注意不要損害貼壁的細(xì)胞。

4.吸去PBS。

5.加入0.25%EDTA(T25加入約1mL，T75加入約2-3mL)。輕輕旋轉(zhuǎn)，使EDTA覆蓋細(xì)胞表面，消

化，顯微鏡下觀(guān)察到約70%-80%左右的細(xì)胞變圓后，用手輕拍培養(yǎng)器皿的壁使細(xì)胞脫壁。

6.當(dāng)看到明顯的細(xì)胞脫落下來(lái)，立即加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基(T25培養(yǎng)瓶加入約3m，T75培養(yǎng)瓶加

入約6 mL)終止消化。

7.用吸管吸取液體，反復(fù)吹打培養(yǎng)器皿底壁，使細(xì)胞徹底脫離器皿底壁。吹打時(shí)動(dòng)作不宜太猛，

盡量避免產(chǎn)生氣泡。

8.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中。

9. 250 g，離心5min。

10,小心棄去上清液。

11.加入2 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。吹打時(shí)動(dòng)作不宜太猛，盡量避免產(chǎn)生氣泡。

12.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量。

13.按照2.5-4.0x104個(gè)活細(xì)胞/cm2的密度來(lái)接種細(xì)胞。

14.加入適量的人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)器皿，使細(xì)胞均勻分布。

15.把細(xì)胞放入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

換液:

臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的換液:

1.傳代后發(fā)現(xiàn)有很多死細(xì)胞，應(yīng)該予以換液。

2.當(dāng)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的完全培養(yǎng)基pH值變酸時(shí)(培養(yǎng)液的顏色變黃)，而且此時(shí)細(xì)胞仍未可以傳

代，則應(yīng)該予以換液。一般來(lái)說(shuō)，人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的換液間隔為2-3天。

（1）傾斜培養(yǎng)瓶，用移液管吸掉7mL培養(yǎng)上清液。

說(shuō)明:吸掉培養(yǎng)上清液時(shí)，盡量不吸走未貼壁的組織塊。

（2）加入7mL完全培養(yǎng)基，搖勻。

凍存:

臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的凍存:

1.待細(xì)胞生長(zhǎng)至可傳代的密度，即可消化準(zhǔn)備凍存。

2.細(xì)胞的消化。

3.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

4.消化后的細(xì)胞懸液經(jīng)250 g離心5 min。

5.小心棄去上清。

6.用10%DMSO凍存液重懸細(xì)胞，并使細(xì)胞的密度為1x106個(gè)活細(xì)胞/mL(或希望達(dá)到的細(xì)胞密度)。

7.把細(xì)胞分裝到凍存管(需提前做好標(biāo)記或貼上標(biāo)簽)中，旋緊凍存管蓋。

8.將封好的凍存管放進(jìn)程序降溫盒，再放入-80℃冰箱。

9.24 h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的脐带血单个核的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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