第 11-12 講 基因功能研究技術(shù)

文章目錄

• 8. 基因功能研究技術(shù)
• • 8.1 基因活性的操控技術(shù)
  • • 8.1.1 過表達(dá) (overexpression)
    • 8.1.2 基因定點(diǎn)突變 (site-directed mutagenessis) 技術(shù)
    • 8.1.3 RNAi 技術(shù)
    • 8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技術(shù)
  • 8.2 基因表達(dá)檢測技術(shù)
  • • 8.2.1 第一代測序技術(shù) Sanger dideoxy sequencing
    • 8.2.2 第二代測序技術(shù)
    • • 8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX
      • 8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition
      • 8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）
    • 8.2.3 第三代測序：單分子測序技術(shù)
  • 8.3 功能調(diào)控與檢測技術(shù)（沒講）
  • • 8.3.1 表達(dá)量
    • 8.3.2 酵母單雜、雙雜交系統(tǒng)
    • 8.3.3 各類相互作用技術(shù)
    • 8.3.4 標(biāo)記和熒光成像技術(shù)

---

8. 基因功能研究技術(shù)

8.1 基因活性的操控技術(shù)

可以過表達(dá)、全部或部分抑制基因的表達(dá)，通過觀察靶基因過表達(dá)或者缺失后生物體的表型變化研究基因功能。

8.1.1 過表達(dá) (overexpression)

• 重組 DNA 技術(shù) (Recombinant DNA technology)：顯性陰性蛋白
• 蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)往往是與其他蛋白質(zhì)分步裝配形成復(fù)合物，一起發(fā)揮作用。如果只是過表達(dá)其中一個(gè)蛋白，可能只是影響復(fù)合物的裝配，而不影響復(fù)合物功能；但如果過表達(dá)蛋白質(zhì)的突變體（利用重組 DNA 技術(shù)，Recombinant DNA technology ），很可能影響整個(gè)復(fù)合物的功能。
  

8.1.2 基因定點(diǎn)突變 (site-directed mutagenessis) 技術(shù)

• 基因定點(diǎn)突變 (site-directed mutagenessis, in vitro)：通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個(gè)（些）氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造 DNA 調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。

聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 的應(yīng)用

(1) 亞克隆 (Subcloning DNA targets using PCR)

• T/A 克隆
• 在引物中加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)
• 平端連接 (Blunt-end Ligation)

◆ 使用 PCR 亞克隆 DNA 靶標(biāo)

◆ 在引物中加入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，PCR 擴(kuò)增后酶切得到粘性末端，連接到載體中去。

(2) 產(chǎn)生 DNA 探針 （兩種方法）

• 直接合成（試劑公司）
• 通過 PCR 產(chǎn)生單鏈 DNA 探針：控制上下游引物的比例，原理類似 TAIL-PCR。
  
• PCR 產(chǎn)生用于體外轉(zhuǎn)錄的模板：在不配對(duì)區(qū)設(shè)計(jì)引物，在引物中加入 T7 promoter 序列（即測序引物），使 PCR 產(chǎn)物含有 T7 promoter，可以用來轉(zhuǎn)錄得到 RNA。
  

(3) PCR 的診斷應(yīng)用

• 使用基因組特異性引物對(duì)檢測病原體
• 篩選未知突變的特定基因
• 使用已知的 STS 標(biāo)記進(jìn)行基因分型

PCR 介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 (重疊延伸法) PCR-mediated in vitro mutagenesis

• 目的：將圖中的 AA/TT 突變?yōu)?CC/GG
• 方法：設(shè)計(jì) 重疊互補(bǔ)引物。
  ① 用上游引物 P1 和下游帶有 GG 突變的引物 P2 擴(kuò)增得到帶突變位點(diǎn) CC 及上游序列 的 DNA 片段；
  ② 用上游帶 CC 突變的引物 P3 和下游引物 P4 擴(kuò)增得到帶突變位點(diǎn) GG 及下游序列的 DNA 片段；（P3 與 P2 引物有重疊區(qū)）
  ③ 將兩個(gè) PCR 產(chǎn)物混合，進(jìn)行 PCR 延伸，此時(shí)只有 5’-3’方向可以延伸。
  ④ 以延伸反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以 P1/P4 為引物擴(kuò)增，得到最終產(chǎn)物。
• 重疊延伸 PCR 技術(shù) (SOE PCR) 是指在 PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用 具有互補(bǔ)末端的引物，使 PCR 產(chǎn)物形成重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)可以很快獲得其他依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物，其成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)。SOE PCR 在基因的定點(diǎn)突變、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有著獨(dú)特的應(yīng)用。
• 原理：在重疊延伸 PCR 中，兩個(gè)重疊的 DNA 片段是分別從兩個(gè)獨(dú)立的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)得到的。預(yù)設(shè)突變構(gòu)建在重疊區(qū)域，存在于兩個(gè)擴(kuò)增片段中。設(shè)計(jì) 4 種引物，用第一對(duì)引物擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)及其上游序列的 DNA 片段，第二對(duì)引物被用來擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游序列的 DNA 片段，兩個(gè)側(cè)翼引物含野生型序列，兩個(gè)突變引物含有希望引進(jìn)的突變位點(diǎn)，如置換插入或缺失。混合兩次 PCR 的產(chǎn)物，由于兩個(gè)突變引物有重疊區(qū)，重疊片段之間退火，延伸成異源雙鏈，加入外側(cè)引物進(jìn)行第三次 PCR，即可得到目標(biāo)突變體。
• 參考資料：
  重疊延伸 PCR
  利用重疊延伸 PCR 技術(shù)進(jìn)行 DNA 的人工合成

多位點(diǎn)突變反應(yīng) (MMR) 策略

• 設(shè)計(jì)兩對(duì)突變引物，突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物（MP1/MP2）中，進(jìn)行兩個(gè)不同的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物上下游各有一個(gè)缺口，連接缺口，再進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。
• 選擇擴(kuò)增的酶比較重要，應(yīng)不具有 3’-5’外切酶活性，使 PCR 擴(kuò)增停止在突變位點(diǎn)處產(chǎn)生缺口（只能線性擴(kuò)增而不能指數(shù)擴(kuò)增）。

● 重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變機(jī)制

• 首先將模板 DNA 分別與引物對(duì) 1（正向誘變引物 FM 和反向引物 R2) 和引物對(duì) 2（正向引物 F2 和反向誘變引物 RM) 退火，通過 PCR1 和 PCR2 擴(kuò)增出兩種靶基因片段。
• FMR2 和 RMF2 片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，用 DNA 聚合酶補(bǔ)平缺口，形成全長雙鏈 DNA, 進(jìn)行 PCR3 擴(kuò)增。
• 最后，用引物 F2 和 R2 擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)的全長 DNA 片段 (PCR4)。

● 大引物誘變法

• 首先用正向突變引物 (M) 和反向引物 (R1), 擴(kuò)增模板 DNA 產(chǎn)生雙鏈大引物 (PCR1), 與野生型 DNA 分子混合后退火并使之復(fù)性。
• 第二輪 PCR2 中加入正向引物 (F2), 與 PCR1 中產(chǎn)生的一條互補(bǔ)鏈配對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈 DNA。
• 由于 P2 的退火溫度顯著高于第一輪 PCR 所使用的引物 M 和 R1, 因此，可以忽略引物 M 和 R1 在本輪反應(yīng)中所造成的干擾。獲得定點(diǎn)突變 PCR 產(chǎn)物以后，一般需進(jìn)行 DNA 序列分析以驗(yàn)證突變位點(diǎn)。

● 參考文獻(xiàn)：改進(jìn)的多片段重疊延伸 PCR 制作基因多位點(diǎn)突變
采用重疊延伸 PCR（overlap extension PCR，OE-PCR） 法：第一輪 PCR 擴(kuò)增出三個(gè)片段，第二輪 PCR 同時(shí)利用三片段重疊延伸產(chǎn)物作為模板擴(kuò)增出目標(biāo)基因突變體，再按常規(guī)分子克隆方法將其連入質(zhì)粒載體。

PCR 介導(dǎo)的缺失突變

• 目的：使基因片段中產(chǎn)生缺失片段（圖中紅色和紫色之間的 DNA 片段）
• 原理與定點(diǎn)突變類似，利用 OE-PCR 的方法，根據(jù)缺失片段兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)可以反向互補(bǔ)的引物 P2/P3，分別與 P1/P4 擴(kuò)增，混合延伸，再將延伸產(chǎn)物用 P1/P4 擴(kuò)增，得到最終產(chǎn)物。

The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) 聚合酶不完全引物延伸

• 參考文獻(xiàn)：The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) method applied to high-throughput cloning and site-directed mutagenesis [PMID: 18988020]
  使用 PIPE 方法，所有主要的克隆操作均通過在擴(kuò)增后立即用 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。普通的 PCR 會(huì)產(chǎn)生不完全延伸產(chǎn)物的混合物。使用簡單的引物設(shè)計(jì)規(guī)則和 PCR，在這些不完全延伸混合物的末端引入短的重疊序列，使互補(bǔ)鏈退火產(chǎn)生雜交的載體/插入序列雜交體。這些雜交體在沒有任何 PCR 后的酶促操作的情況下直接轉(zhuǎn)化為受體細(xì)胞。

• 利用 PIPE 進(jìn)行克隆，在載體中插入一個(gè)外源基因（A.B）/ 突變 (C.)
  

• PIPE 方法中使用的（A.B.C）三種常見 PCR 擴(kuò)增的寡核苷酸設(shè)計(jì)，每個(gè)引物 5 '末端的前 15 個(gè)堿基被設(shè)計(jì)成互補(bǔ)序列。
  A. V-PIPE (vector PCR)：引物 1 和 2 可用于擴(kuò)增載體，例如 SpeedET。
  B. I-PIPE（插入 PCR)：引物 3 和 4 可以用于擴(kuò)增來自不同模板的插入片段（目的片段）。
  P1 與 P3 ，P2 與 P4 的 5’端有 15 個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列（overlap），因此目的片段可以與載體重組相連 。
  C. M-PIPE（突變 PCR)：引物 5 和 6 可用于產(chǎn)生點(diǎn)突變。引物 7 和 8 可用于構(gòu)建缺失突變體。引物 9 和引物 10 可用于構(gòu)建插入突變體。

• 參考文獻(xiàn)：基于 PIPE 現(xiàn)象的質(zhì)粒克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)與功能評(píng)價(jià)

8.1.3 RNAi 技術(shù)

• RNAi (RNA interference, RNA 干擾）技術(shù)：利用雙鏈 miRNA 高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源 mRNA 從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi 的命名來源于安德魯·法爾。

• 雙鏈 miRNA 是 RNAi 的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈 RNA (ssRNA, single-stranded RNA）的降解。細(xì)胞核中 DNA 轉(zhuǎn)錄出 pre-miRNA，加工后形成帶 loop 環(huán)的雙鏈 miRNA 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

• 經(jīng)過 Dicer酶（一種具有 RNAaseⅢ 活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長的雙鏈 RNA (30 個(gè)核苷酸以上）首先被降解（切掉 loop 環(huán)）形成 21～25 個(gè)核苷酸的小分子干擾核糖核酸 (siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目標(biāo) mRNA。siRNA 是導(dǎo)致基因沉默和序列特異性 RNA 降解的重要中間媒介。

• 較短的雙鏈 RNA 不能被有效地加工為 siRNA, 因而不能介導(dǎo) RNAi。

• siRNA 具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即 5’-Pi 和 3’-OH，其兩條鏈的 3’端各有兩個(gè)堿基突出于末端。由 siRNA 中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RISC) 的核蛋白體，再由 RISC 介導(dǎo)切割目的 mRNA 分子中與 siRNA 反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。

• siRNA 還可作為特殊引物，在依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶的作用下，以目的 mRNA 為模板合成 dsRNA, 后者又可被降解為新的 siRNA, 重新進(jìn)人上述循環(huán)。因此，即使外源 siRNA 的注入量較低，該信號(hào)也可能迅速被放大，導(dǎo)致全面的基因沉默。

• 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，較長的 dsRNA 會(huì)導(dǎo)致非特異性基因沉默，只有 21~25 個(gè)核苷酸的 siRNA 才能有效地引發(fā)特異性基因沉默 。

• 非哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以利用較長的雙鏈 RNA 直接誘導(dǎo)產(chǎn)生 RNAi 而無須合成 siRNA, 因此，設(shè)計(jì)非哺乳動(dòng)物細(xì)胞 RNAi 實(shí)驗(yàn)的步驟比較簡便，只要通過目的基因體外轉(zhuǎn)錄得到所需要的 dsRNA, 再通過浸泡，注射或轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn) RNAi。

8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技術(shù)

• 經(jīng)典遺傳學(xué) (Forward genetics）是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列。
• 現(xiàn)代遺傳學(xué) (Reverse genetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測或者觀察表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能。
• 基因敲除 (gene knock-out) 又稱基因打靶，通過外源 DNA 與染色體 DNA 之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體 DNA 可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。

基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。
完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)植物個(gè)體中的靶基因活性。
條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。

(1) 完全基因敲除實(shí)驗(yàn)

完全基因敲除實(shí)驗(yàn)中一般采用取代型 (a) 或插入型 (b) 載體在 ES 細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞 embryonic stem cell）中根據(jù)正-負(fù)篩選 ( positive-negative selection, PNS) 原理進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)。

• 正向選擇基因 neo 通常被插入載體靶 DNA 功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)。neo 基因有雙重作用，一方面形成靶位點(diǎn)的插入突變，同時(shí)可作為正向篩選標(biāo)記。
• 負(fù)向選擇基因 HSV-tk (human semian virus-thymidine kinase，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因） 則被置于目的片段外側(cè)，含有該基因的重組細(xì)胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長。如果細(xì)胞中發(fā)生了隨機(jī)重組，負(fù)向選擇基因就可能被整合到基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
• 正-負(fù)篩選法 (PNS 法） 篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞（此方法效率低，現(xiàn)已不用于做基因敲除，用 CRISPR 方法）
  
  ◆ 目標(biāo)序列的關(guān)鍵外顯子中插入 neo^r 基因，兩側(cè)為 HSV-tk；
  ◆ 在 ES 細(xì)胞中發(fā)生同源重組后，neo^r 基因插入基因組中，而 HSV-tk 基因被剪切掉；
  ◆ 發(fā)生重組的 ES 細(xì)胞由于有 neo^r 基因而獲得對(duì)新霉素 G148 抗性。因?yàn)槿笔Я?HSV-tk 基因，轉(zhuǎn)化細(xì)胞同時(shí)具有嘌呤類似物丙氧鳥苷抗性。

高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)

• 真核生物基因敲除的技術(shù)路線：構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組 DNA 導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源 DNA 與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的 DNA 序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。
• 顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對(duì)大些。
• 電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。
• 胚胎干細(xì)胞（ES 細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。

模式動(dòng)物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用

• 腸堿性磷酸酶（Intestinal Alkaline Phosphatase，IAP）基因敲除加速小鼠肥胖
  
• (a) 利用 neo 基因替換目的基因外顯子Ⅳ至外顯子Ⅵ區(qū)段，得到 IAP 基因敲除的 ES 細(xì)胞。P. 內(nèi)源 Southern 印跡探針。
• (b) Southerm 印跡實(shí)驗(yàn) （DNA 水平），AP 基因已從基因組中敲除。
  ◆ D3, 來自于親本 ES 細(xì)胞的 DNA;
  ◆ # 48, IAP 基因敲除的 ES 細(xì)胞 DNA;
  ◆ +/+、+/-和-/-分別代表野生型、雜合體和純合體。
• (c ) Northem 印跡實(shí)驗(yàn) （RNA 水平），純合小鼠體內(nèi) IAP 基因不表達(dá)。
• (d) Western 印跡實(shí)驗(yàn) （蛋白質(zhì)水平）。純合小鼠體內(nèi)檢測不到 IAP 蛋白。TNAP, 非組織特異性堿性磷酸酶。
• (e) 在高脂飼養(yǎng)條件下，IAP 基因敲除的小鼠 ( ko) 較野生型小鼠 ( wr) 更易發(fā)胖。

(2) 條件型基因敲除

• 噬菌體的 Cre/LoxP 系統(tǒng)、Gin/Gix 系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的 FLP/FRT 系統(tǒng)和 R/RS 系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種條件型定位重組系統(tǒng)，尤以 Cre/LoxP 系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。

Cre/LoxP 系統(tǒng)

• Cre 是來自大腸桿菌噬菌體 P1 中的一種特異重組酶，能識(shí)別 34bp 的 loxP 序列（序列短，容易插入基因組），并介導(dǎo)兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的基因序列被刪除或重組。

• loxP 序列：來源于 P1 噬菌體，是由兩個(gè) 13bp 反向重復(fù)序列和中間間隔的 8bp 序列共同組成，8bp 核心序列同時(shí)也確定 LoxP 的方向。Cre 在催化 DNA 鏈交換過程中與 DNA 共價(jià)結(jié)合，13bp 的反向重復(fù)序列是 Cre 酶的結(jié)合域。其序列如下：
  5’ - ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT - 3’
  3’ - TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA - 5’

• Cre 重組酶介導(dǎo)兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過程，可以分成三種情況：
  
  ◆ Cre-lox 重組的結(jié)果取決于側(cè)翼 loxP 位點(diǎn)的方向和位置：
  ① 如果兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)位于一條 DNA 鏈上，但方向相反，Cre 重組酶能導(dǎo)致兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)間的序列 倒位；
  ② 如果兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)分別位于兩條不同的 DNA 鏈或染色體上（反式排列），Cre 酶能介導(dǎo)兩條 DNA 鏈的交換或染色體易位。
  ③ 如果兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)位于一條 DNA 鏈上，且方向相同（順式排列），Cre 重組酶能有效切除兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)間的序列。

條件型基因敲除策略

• 條件型基因敲除打靶載體時(shí)，常將正向選擇標(biāo)記 neo^r 置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域（如圖中 Exon 2）兩側(cè)內(nèi)含子中插入方向相同的 LoxP 位點(diǎn)。
• 當(dāng)實(shí)驗(yàn)中需要消除靶基因活性時(shí)，與帶有 Cre 重組酶基因的 ES 細(xì)胞雜交，Cre 重組酶就能把兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)中間的 DNA 片段切除，導(dǎo)致靶基因失活。
• 標(biāo)記基因 neo^r 兩側(cè)也常常帶有 LoxP 序列，因?yàn)樵S多時(shí)候即使標(biāo)記基因位于內(nèi)含子中也會(huì)阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄。一旦出現(xiàn)這種情況，可以用 Cre 重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶 ES 細(xì)胞，通過 LoxP 位點(diǎn)重組將 neo 抗性基因刪除。

肝組織特異性表達(dá) Cre-Lox 系統(tǒng)條件型敲除小鼠 40S 核糖體蛋白 S6 基因導(dǎo)致肝細(xì)胞分裂增殖受阻

● Conditional KO mice: inducible cre-lox recombination
Cre 重組酶融合至突變體雌激素配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其需要存在雌激素拮抗劑他莫昔芬用于激活重組酶 (CreERT2）。

● 細(xì)胞特異性 Tet-ON （四環(huán)素誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)）
TetO（四環(huán)素響應(yīng)啟動(dòng)子/操縱子）在用四環(huán)素類似物強(qiáng)力霉素（DOX）激活反向四環(huán)素反式激活因子 (rtTA）后驅(qū)動(dòng) cre 重組酶的表達(dá)。

基因捕獲法原理

• 除了基因敲除法，還有人用基因捕獲的方法通過隨機(jī)插入突變破壞靶基因表達(dá)。
• 基因捕獲載體包括一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)告基因（通常為 neo^r 基因）, 當(dāng)該基因插入到 ES 細(xì)胞染色體某個(gè)部位，利用所在位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件得到表達(dá)時(shí)，該 ES 細(xì)胞就獲得在含 G418 的選擇性培養(yǎng)基上生長的能力。可通過分析標(biāo)記基因側(cè)翼 cDNA 或染色體 DNA 序列來獲得靶基因的相關(guān)信息。

• A、未插入基因捕獲載體前，需要被敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白質(zhì)，未知；
• B、插入基因捕獲載體后，靶位點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄翻譯出帶有 GUS 蛋白區(qū)段的融合蛋白，可用組化方法檢測。
• Gus 基因來自于大腸桿菌，編碼 β-葡聚糖苷酶 (β-glucuronidase，一種水解酶），可催化底物 5-溴-4-氯-3-吲哚葡聚糖醛酸苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide, 縮寫為 x-Gluc）分解，產(chǎn)生肉眼可見的深蘭色化合物，借此用來觀察轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的表達(dá)情況，鑒定轉(zhuǎn)基因植株。

植物基因敲除技術(shù)

• T-DNA 插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。
• 利用根癌農(nóng)桿菌 T-DNA 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報(bào)告基因的 DNA 序列整合到基因組 DNA 上，如果這段 DNA 插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”。
• 由于該基因內(nèi)部或附近插入了一段已知序列的 DNA, 可據(jù)此設(shè)計(jì)引物，用 PCR 方法將被破壞的靶基因序列分離出來。
• 植物基因敲除及突變體篩選
  
  若將靶基因（假定編碼區(qū)為 900 bp) 兩端的引物 LP、RP 及插入載體上的引物 LB 加入同一反應(yīng)體系中進(jìn)行 PCR, 理論上能得到三種類型的條帶：
  ◆ 野生型植株中，只有 LP 和 RP 引物配對(duì)擴(kuò)增出來的靶基因條帶；
  ◆ 純合型基因敲除植株，只有靶基因一端的引物可以與 LB 引物配對(duì)完成 PCR 擴(kuò)增；
  ◆ 雜合型基因敲除植株，PCR 擴(kuò)增后會(huì)同時(shí)出現(xiàn)兩種條帶。

基因的定點(diǎn)整合技術(shù)

（一） TALEN 介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)

• TALEN: transcription activator-like effector nucleases 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶，是一類人工核酸內(nèi)切酶。由特異性的TALE DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性FokⅠ核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域組成。
• 人工構(gòu)建的序列特異性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別并切割特定的 DNA 靶序列，造成雙鏈斷裂，從而引起基因組結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)改變。
• 參考資料★★★：TALEN 介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù) .ppt

● TALE 識(shí)別模塊

• RVD: Repeat variable di-residue 重復(fù)可變雙殘基
  NLS: Nuclear localization signal 核定位信號(hào)
  AD: Activation domain 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域
• TALE 蛋白 N 端一般有轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)；C 端有核定位信號(hào)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域；中部 則是介導(dǎo)其與 DNA 特異識(shí)別與結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，包含一段 12 個(gè)或以上的長串聯(lián)重復(fù)序列。
• 在每個(gè)重復(fù)單位中，包含 34 個(gè)氨基酸，第 +12 和+13 位氨基酸殘基是靶向識(shí)別堿基的關(guān)鍵位點(diǎn)，隨靶點(diǎn)核苷酸序列的不同而異，被稱作重復(fù)可變雙殘基 (Repeat variable di-residue, RVD)；其他位置的氨基酸殘基則相對(duì)固定。
• 每個(gè) RVD 只能識(shí)別一個(gè)堿基。最常見的 4 種 RVD 分別是 NI(Asn Ile) 識(shí)別 A、NG(Asn Gly) 識(shí)別 T、HD(His Asp) 識(shí)別 C、 NN(Asn Asn) 識(shí)別 G/A。TALE 的重復(fù)單元與靶序列一一對(duì)應(yīng)。

● TALEN 介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾流程

• 在實(shí)際操作中，需在目標(biāo)基因的編碼區(qū)或外顯子和內(nèi)顯子的交界處選擇兩處相鄰（間隔 13-22 堿基）的靶序列（一般 16-20 個(gè)堿基）分別進(jìn)行 TALE 識(shí)別模塊構(gòu)建。將這兩個(gè)相鄰靶點(diǎn)識(shí)別模塊（分別）融合克隆到 FokⅠ 的 N-末端，形成真核表達(dá)載體，得到 TALEN 質(zhì)粒對(duì)。將 TALEN 質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)靶基因敲除。
• TALEN 質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)的融合蛋白，分別與靶位點(diǎn)特異結(jié)合，由于兩個(gè) TALEN 融合蛋白中的 FokⅠ 臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性（FokⅠ只有形成二聚體才切），在兩個(gè)靶位點(diǎn)之間剪切 DNA，造成 DNA 雙鏈斷裂 DSB (Double-Strand Breaks，DSB)，誘發(fā) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制。
• 切割后（細(xì)胞 DNA 損傷后）會(huì)啟動(dòng)兩種修復(fù)機(jī)制：
  ① 非同源末端連接 NHEJ（Non-homologous End Joining）修復(fù)：簡單高效，錯(cuò)誤率高，>70% 產(chǎn)生基因突變，造成移碼，形成目標(biāo)基因敲除突變體。
  ② 同源重組 HR 修復(fù)：有模板存在時(shí)發(fā)生同源重組，造成基因敲入和修改，效率低，保真度高。

● TALEN 靶位點(diǎn)的挑選原則：

• TALEN 靶位點(diǎn) 5 端的前一位（第 0 位）堿基應(yīng)為胸腺喀啶 (T)
• 設(shè)計(jì) TALEN 靶點(diǎn)網(wǎng)站：TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0

（二） CRISPR/Cas 系統(tǒng)

• 在原核生物中，聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列 (CRISPR）和 CRISPR 相關(guān) (Cas) 系統(tǒng) (clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system) 是針對(duì)病毒和質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞，使用引導(dǎo) RNA 來切割外源 DNA 序列。
• Ⅱ型 CRISPR 系統(tǒng) 體外切割所需的最小組分是來自化膿鏈球菌 (Streptococcus pyogenes）的 Cas9 核酸酶和合成的指導(dǎo) RNA (sgRNA)。sgRNA 由短 CRISPR RNA(crRNA）和反式激活 CRISPR RNA ( tracrRNA）組成。
• 原理與 TALEN 類似，不同的是，CRISPR/Cas 是通過 sgRNA 來識(shí)別靶 DNA 序列。

CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯

• CRISPR 系統(tǒng)使用單個(gè)指導(dǎo) RNA（紅色）靶向感興趣的 DNA。
• Cas9 核酸酶（綠色）識(shí)別 sgRNA 和 RNA:DNA 雜交體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過 crRNA 內(nèi)的 20bp 序列提供基因組特異性。
• Cas9 還需要原型間隔區(qū)基序 5’-NGG-3’ (Protospacer-Adjacent Motif, PAM）來切割 DNA。

• CRISPR/Cas9 切割后修復(fù)：
  1）基因敲除：在基因上產(chǎn)生 DSB ( 3bp upstream of the PAM site )，NHEJ 修復(fù)的過程中往往會(huì)產(chǎn)生 DNA 的插入或刪除（indel)，造成移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。
  2）特異突變引入：通過含有特異突變同源模板的同源重組 (homology directed repair，HDR) 來實(shí)現(xiàn)。DSB 會(huì)極大的提高重組效率，從而實(shí)現(xiàn)特異突變的引入。
  3）定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因：通過含有轉(zhuǎn)基因的同源模板的同源重組來實(shí)現(xiàn)。通過定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因的方法可以把基因插入到人的基因組 AAVS1 位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)是一個(gè)開放位點(diǎn)，支持轉(zhuǎn)基因長期穩(wěn)定的表達(dá)，破壞這個(gè)位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞沒有不良影響。

• CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已不僅僅是一種革命性的基因編輯工具，還能在各種原核和真核生物中調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Cas9 的核酸酶發(fā)生雙突變產(chǎn)生失活的 dCas9，即“dead Cas9"”，這種核酸酶失去切割 DNA 的功能，但在 gRNA 的指導(dǎo)下仍能以相同的精確度靶向和結(jié)合 DNA。

• 參考文獻(xiàn)： Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells
  有別于絕大多數(shù)體細(xì)胞基因組，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中可以進(jìn)行高效編輯，對(duì)抗原受體進(jìn)行高效突變，產(chǎn)生近乎無限的抗原受體庫，用以抵御可能的病原體入侵。受這一機(jī)制的啟發(fā)，研究小組發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)抗體高頻突變的胞喀啶核苷脫氨酶（ activation-induced cytidine deaminase，AID）與失活的 dCas9 融合后，實(shí)現(xiàn)了功能變異的高通量篩選。在 sgRNAs 的引導(dǎo)下，dCas9-AID-P182X(AIDx) 可直接將胞密啶 C 或鳥嘌呤 G 轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌N堿基，在預(yù)期位點(diǎn)產(chǎn)生一系列的變異。

• 參考資料：
  CRISPR/Cas 技術(shù)及其作用機(jī)制
  CRISPR-dCas9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)簡介

單堿基編輯 Single base editing

• 參考文獻(xiàn)： Programmable base editing of AT to G·in genomic DNA without DNA cleavage
  
• 不同于 CRISPR，堿基編輯不會(huì)切割雙螺旋，而是使用酶將堿基轉(zhuǎn)換為堿基而不改變其周圍的堿基。
• 利用 CRISPR-dCas9 定位到目標(biāo)堿基處，dCas9 融合了一種特殊的酶（能對(duì)堿基發(fā)生修飾）

載體構(gòu)建實(shí)例解析
詳見：載體構(gòu)建實(shí)例解析——構(gòu)建 SETD3-pEGFP-N1

---

8.2 基因表達(dá)檢測技術(shù)

為研究單個(gè)或多個(gè)基因在生物體某些特定發(fā)育階段或在不同環(huán)境條件下的表達(dá)模式提供了強(qiáng)有力的手段。

基因組序列的測定

基因組（genome）是生物體內(nèi)遺傳信息的集合，是某個(gè)特定物種細(xì)胞內(nèi)全部 DNA 分子的總和。
基因組學(xué)（genomics）是指研究并解析生物體整個(gè)基因組的所有遺傳信息的學(xué)科。

● 不同模式生物基因組的比較

鳥槍法序列測定技術(shù)

• 全基因組鳥槍法測序 (shotgun sequencing) 技術(shù)：隨機(jī)挑選帶有基因組 DNA 的質(zhì)粒進(jìn)行末端序列測定，然后用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列拼接。
• 鳥槍法測序的主要缺點(diǎn)：
  1）隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加；
  2）高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，無法知道拷貝數(shù)，導(dǎo)致判斷失誤。

組裝單個(gè)序列

1）將各個(gè)測序讀數(shù)相互比較，并將它們重疊的位置組合以產(chǎn)生重疊群；
2）繼續(xù)添加單個(gè)測序讀數(shù)以構(gòu)建更大和更少的重疊群；
3）最終，所有測序讀數(shù)合并為每個(gè)染色體的單個(gè)共有序列 (大重疊群）。

基因表達(dá)通量檢測技術(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

• 轉(zhuǎn)錄組 (transcriptome)，廣義上指在某一特定生理?xiàng)l件或環(huán)境下，一個(gè)細(xì)胞、組織或者生物體中所有 RNA 的總和，包括信使 RNA (mRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn) RNA ( tRNA) 及非編碼 RNA (non-coding RNA 或 siRNA)。現(xiàn)常指細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有 mRNA 的總和。
• 基因組-轉(zhuǎn)錄組-蛋白質(zhì)組（genome-transcriptome-proteome) 是中心法則在組學(xué)框架下的主要表現(xiàn)形式。
• 通過特定生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 豐度來描述基因表達(dá)水平并外推到最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的豐度是目前基因表達(dá)研究的基本思路。

● 基于傳統(tǒng)的 Sanger 測序法對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究的方法主要包括：
① 表達(dá)序列標(biāo)簽 (expressed sequence tag, EST) 測序技術(shù)：

• 在遺傳學(xué)中，表達(dá)序列標(biāo)簽或 EST 是 cDNA 序列的短子序列。用于 EST 產(chǎn)生的 cDNA 通常是來自 cDNA 文庫的單個(gè)克隆。
• EST 測序數(shù)據(jù)是目前數(shù)量最多、涉及物種最廣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但測序讀長較短（每個(gè)轉(zhuǎn)錄物測定 400 ~ 500 bp)，測序通量小，測序成本較高，而且無法通過測序同時(shí)得到基因表達(dá)豐度的信息。
• ESTs 可用于鑒定基因轉(zhuǎn)錄物，并有助于基因發(fā)現(xiàn)和基因序列測定。
• EST 代表表達(dá)基因的部分序列。它們?cè)跀?shù)據(jù)庫中可以表示為 cDNA /mRNA 序列或作為 mRNA 的反向互補(bǔ)物，即模板鏈。
• EST 包含足夠的信息以允許設(shè)計(jì)用于 DNA 微陣列的精確探針，然后可用于確定基因表達(dá)。

② 基因表達(dá)系列分析 (serial analysis of expression, SAGE) 技術(shù)。有人使用 SAGE 測序法，用不同轉(zhuǎn)錄物 3’端第一個(gè) CATG 位點(diǎn)下游 14 bp 長的短標(biāo)簽序列來標(biāo)識(shí)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物。由于標(biāo)簽序列較短，可以將多個(gè)標(biāo)簽串聯(lián)測序，使 SAGE 法相對(duì)于 EST 測序在通量上大大提高。但過短的序列標(biāo)簽降低了序列的唯一性，即使用改進(jìn)過的 LongSAGE(21 bp) 標(biāo)簽測序，仍然有一半的標(biāo)簽無法被準(zhǔn)確注釋到基因組上。

高通量測序技術(shù) (high-throughput sexquencing) ，又名二代測序 (second-generation sequencing) 或深度測序 (deep sequencing), 可以一次性測定幾十萬甚至幾百萬條序列，是傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命，主要有 454 測序平臺(tái)和 Solexa 測序平臺(tái)。

基因表達(dá)水平檢測

• Northern 雜交：檢測 RNA 表達(dá)水平
• 表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）測序技術(shù)
• 基因芯片技術(shù) (DNA/RNA chip)
• 數(shù)字表達(dá)譜 DGE (Digital Gene Expression)

原位雜交技術(shù)

• 原位雜交 (In Situ Hybridization，ISH) 是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段，分為 RNA 和染色體原位雜交兩大類。
• RNA 原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的 mRNA 分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈 RNA，可通過放射性標(biāo)記或經(jīng)殉促免疫顯色，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物做出定性定量分析。
• 用 mRNA 的互補(bǔ)鏈為探針進(jìn)行雜交。負(fù)對(duì)照，mRNA 的同義鏈，無雜交信號(hào)。
• 熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 技術(shù)首先對(duì)寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或 DNA 上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該 DNA 序列在染色體上的位置。
• FISH 技術(shù)不需要放射性同位素，實(shí)驗(yàn)周期短，檢測靈敏度高，若用經(jīng)過不同修飾的核苷酸分子標(biāo)記不同的 DNA 探針，還可能在同一張切片上觀察幾種 DNA 探針的定位，得到相應(yīng)位置和排列順序的綜合信息。

表達(dá)芯片/基因芯片

• 基因芯片（DNA chip），又稱 DNA 微陣列 (DNA microarray）技術(shù)是能同時(shí)監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。
• 基因芯片可用于進(jìn)行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖，用可疑病人的 cDNA 做探針與之雜交，確定哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。

數(shù)字表達(dá)譜 (Digital Gene Expression)

• 數(shù)字基因表達(dá)譜（Digital Gene Expression Profiling, DGE）利用新一代高通量測序技術(shù)和高性能計(jì)算分析技術(shù)，能夠全面、經(jīng)濟(jì)、快速地檢測某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況。
  

DNA 測序技術(shù)

● 第一代測序技術(shù) Sanger dideoxy sequencing

● 第二代測序技術(shù)

• Roche 454 Pyrosequencing
• lllumina Solexa cyclical base addition
• ABI SOLiD sequencing by ligation

● 第三代測序技術(shù)

• Single molecule sequencing
• Heliscope (cyclical base addition)
• Pacific Biosciences

8.2.1 第一代測序技術(shù) Sanger dideoxy sequencing

● 第一代測序技術(shù)的特點(diǎn)

DNA 片斷化

克隆到質(zhì)粒載體上

循環(huán)測序反應(yīng)

通過電泳分離

帶熒光標(biāo)簽的讀數(shù)

<1000bp/read, 96 lanes

● 原理：sanger 法測序 及 雙脫氧鏈終止法，它采取 DNA 復(fù)制原理，通過在 DNA 復(fù)制過程中添加雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP），由于它沒有 3’-OH，故不與下一個(gè) dNTP 結(jié)合，從而使鏈延伸終止。ddNTP 在不同位置摻入，因而在 DNA 鏈不同位置發(fā)生延伸終止，產(chǎn)生一系列不同長度的新的 DNA 鏈，判斷該位置的堿基類型。但是凝膠電泳的時(shí)間較長，導(dǎo)致 sanger 法測序通量低。

● 核糖核苷三磷酸 (NTP)、脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP) 和雙脫氧核糖核三磷酸 (ddNTP) 的結(jié)構(gòu)

● DNA 合成是生成磷酸糖苷鍵的過程：單核苷酸 5’-磷酸基團(tuán)向核酸鏈的 3’-OH 發(fā)起進(jìn)攻。

● 目前所有測序都是以單鏈 DNA 為模板，在引物存在的情況下，讀加上去的堿基，測序?qū)嶋H上是 DNA 邊合成邊檢測的過程。

Sanger-Coulson 測序（使用單鏈 DNA 的鏈終止方法）

將待測序的樣品 DNA 克隆到 M13 載體 DNA 中以產(chǎn)生單鏈 DNA (ssDNA)。

將短寡核苷酸引物（化學(xué)合成并有時(shí)標(biāo)記）加入單鏈重組 DNA 中。

然后將 DNA 聚合酶（Klenow 大片段，無 5’-3’ 外切酶活性）加入 ³²P 標(biāo)記的 dNTP 混合物分別加入四種低濃度的 ddNTP（極少量，所以會(huì)隨機(jī)發(fā)生 DNA 合成終止，得到很多提前終止的產(chǎn)物）。注意：這里是標(biāo)記 dNTP，不標(biāo)記 ddNTP。

發(fā)生互補(bǔ)鏈合成。

4 種混合物電泳，測序凝膠根據(jù)其大小通過電泳分離片段。通過放射自顯影觀察凝膠中的 DNA 條帶。

直接從凝膠中讀取 DNA 序列。

Sanger 測序法的改進(jìn) (ABI 3730)

• 熒光標(biāo)簽代替放射性同位素：4 種不同的雙脫氧核苷酸 (ddA，ddC，ddG 和 ddT) 被熒光標(biāo)記。使用 4 種不同的熒光團(tuán)，所有 4 種反應(yīng)均可在同一管中進(jìn)行。注意：這里是標(biāo)記 ddNTP，不標(biāo)記 dNTP。
• 毛細(xì)管電泳代替普通的平板電泳。
• 自動(dòng)化操作。
  

8.2.2 第二代測序技術(shù)

• 原理：加堿基-讀-洗 循環(huán)。先擴(kuò)增，得到大量模板，然后一個(gè)個(gè)加堿基，加一個(gè)堿基就停止反應(yīng)，洗掉，再換另一個(gè)堿基，再停止反應(yīng)洗掉，以此循環(huán)。例如先加 A，所有能結(jié)合的就發(fā)光，洗掉保護(hù)基團(tuán)，再換 T，再換 C、G…

• 核心技術(shù)：
  ① 橋式 PCR，主要用于擴(kuò)大信號(hào)；
  ② 4 色熒光可逆終止反應(yīng)，使 illumina 測序可以實(shí)現(xiàn)邊合成邊測序的技術(shù)。

8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX

● Roche / 454 的特點(diǎn)

• 實(shí)時(shí)合成測序：454 焦磷酸測序直接檢測核苷酸合成時(shí)相應(yīng)產(chǎn)物誘發(fā)的光信號(hào)，是基于合成的實(shí)時(shí)測序。
• 皮升滴定板中的化學(xué)發(fā)光檢測
• 擴(kuò)增：乳膠 PCR (Emulsion PCR)。
• 焦磷酸測序
• up to 1,000,000 reads / run
• on average 700 bases / read
• up to 700 Mb / run

● 原理：將隨機(jī)片段化后的基因組 DNA 變性成單鏈并稀釋，讓每個(gè)磁珠通過表面引物“捕獲”至多一個(gè) DNA 分子。然后每個(gè)磁珠在封閉的 乳膠小泡中 PCR 擴(kuò)增至數(shù)千拷貝（模板），再次變性去除游離的 DNA 分子。富集磁珠并置于光纖載片的小槽內(nèi)，以 4 種天然核苷酸為底物合成互補(bǔ)鏈。當(dāng)某個(gè)新添加的核苷酸被整合到延伸的 DNA 鏈中，它 釋放的焦磷酸被硫酸化酶轉(zhuǎn)化成 ATP，熒光素酶利用這個(gè) ATP 催化熒光素釋放光信號(hào)，被光纖束連接的 CCD 檢測到。

● 將一種比 PTP 板 (Pico TiterPlate) 上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動(dòng)測序反應(yīng)。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈 DNA 為模板，每次反應(yīng)加入一種 dNTP 進(jìn)行合成反應(yīng)。

● 優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)其它二代測序技術(shù)，主要優(yōu)點(diǎn)是測序讀長較長（平均讀長 400bp，因?yàn)闆]有對(duì) dNTP 做修飾，反應(yīng)可以不斷進(jìn)行），應(yīng)用于從頭拼裝測序等。

● 缺點(diǎn)：由于沒有對(duì)底物核苷酸進(jìn)行任何末端終止的修飾，無法準(zhǔn)確測量同聚物（重復(fù)序列）的長度，如當(dāng)序列中存在類似于 PolyA 的情況時(shí)，測序反應(yīng)會(huì)一次加入多個(gè) T，而所加入的 T 的個(gè)數(shù)只能通過熒光強(qiáng)度推測獲得（隨著反應(yīng)的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸衰減，所測的熒光強(qiáng)度不能準(zhǔn)確反應(yīng)堿基數(shù)量），這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

● 堿基插入和缺失 是該方法的主要測序錯(cuò)誤。

焦磷酸測序技術(shù) ★★★

• 焦磷酸測序技術(shù)是由 4 種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
• 焦磷酸測序技術(shù)的原理是：引物與模板 DNA 退火后，在 DNA 聚合酶 (DNA polymerase)、ATP 硫酸化酶 (ATP sulfurytase)、熒光素酶 (luciferase) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶 (Apyrase) 4 種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè) dNTP 的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定 DNA 序列的目的。
• 焦磷酸測序技術(shù)的反應(yīng)體系：反應(yīng)底物、待測單鏈、測序引物和 4 種酶構(gòu)成。
• 反應(yīng)底物： 5’-磷酰硫酸 (adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、熒光素 (luciferin)。
• 反應(yīng)過程：在 每一輪測序反應(yīng)中，反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)。如果它剛好能和 DNA 模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在 DNA 聚合酶的作用下，添加到測序引物的 3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸 (PPi)。在 ATP 硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 可以和 APS 結(jié)合形成 ATP, 在熒光素酶的催化下，生成的 ATP 又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個(gè)特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的 dNTP 不能和 DNA 模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則上述反應(yīng)不會(huì)發(fā)生，也就沒有檢測峰。反應(yīng)體系中剩余的 dNTP 和殘留的少量 ATP 在 Apyrase 的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應(yīng)完成后，加入另一種 dNTP，使上述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的 DNA 序列信息。
• 焦磷酸測序技術(shù)的應(yīng)用：研究單核苷酸多態(tài)性 (single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遺傳多態(tài)性，植物多態(tài)性分析，分子診斷細(xì)菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。
• 該技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對(duì) DNA 樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)。

8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition

● lllumina 二代測序流程

制備單鏈模板

成簇 cluster：擴(kuò)增模板，放大信號(hào)

測序

數(shù)據(jù)分析：讀數(shù) counts

lllumina / Solexa: 遺傳分析儀的特點(diǎn)

• 實(shí)時(shí)合成測序
• 克隆單分子陣列
• 擴(kuò)增：橋接 PCR
• 3 billions reads / run
• 100-250 bases / read
• 600 Gb / run
• 8 channels（一次可測 8 個(gè)樣品）, ~400 mill reads / channel
• 熒光標(biāo)簽：加入的每個(gè)堿基都有熒光標(biāo)記
• 可逆 3’-OH 阻斷
• 11 days for 2x100bp

基于可逆終止子的測序 (Solexa)

• 反應(yīng)過程：先隨機(jī)片段化基因組 DNA，然后將各個(gè)單鏈模板與固相基底上的正、反向 PCR 引物 隨即雜交引起互補(bǔ)鏈合成，隨后經(jīng)過 DNA 變性引起 鄰近引物橋式擴(kuò)增。不同模板生成的擴(kuò)增子集群散布在基底的不同位置，形成陣列。測序過程中，測序引物與模板末端的共同接頭序列雜交，在 DNA 聚合酶催化下以 4 種 3’-OH 位置加了一個(gè)可切除修飾基團(tuán)的核苷酸為底物合成互補(bǔ)鏈。每一輪鏈延伸只有一個(gè)堿基整合，因?yàn)?strong>修飾基團(tuán)會(huì)阻止下一個(gè)核苷酸整合。每個(gè)核苷酸還帶有一個(gè)可切除的熒光標(biāo)記基團(tuán)。也就是說，每一輪鏈延伸，都檢測一遍熒光圖像信號(hào)，檢測完后切除修飾基團(tuán)和熒光基團(tuán)，進(jìn)入下一輪合成。
• 調(diào)用原始數(shù)據(jù)，從連續(xù)圖像中依次讀出每一個(gè)熒光簇的不同顏色信號(hào)：每一種顏色代表一種堿基。

lllumina 測序的基本化學(xué)原理：Sanger Sequencing 雙脫氧鏈終止法

• 詳見：illumina 二代測序原理及過程 ★★★
• 單鏈模板制備：加 1% NaOH。
• 可逆 3’-OH 阻斷：阻斷 3’-OH 可終止延伸，實(shí)現(xiàn)加一個(gè)堿基就停止反應(yīng)；這個(gè)阻斷過程是可逆的，能繼續(xù)加下一個(gè)堿基。
• 對(duì)堿基修飾：帶有可切除的熒光基團(tuán)和修飾基團(tuán)的堿基。ATCG 帶不同顏色的熒光基團(tuán)；可切除的修飾基團(tuán)實(shí)現(xiàn)可逆的 3’-OH 阻斷。
• 讀取堿基的原理：模板在板上固定位置形成簇，每個(gè)簇的位置是固定的（即模板是固定的，同一個(gè)位置測的是同一條鏈），因此，根據(jù)每一次反應(yīng)后板上的熒光變化，即可分辨加上的堿基。
• Solexa 系統(tǒng)主要的錯(cuò)誤出在 堿基替換。
• 讀長受限的原因 （為什么不能像一代測序一樣測 500bp 以上？)
  ① 修飾基團(tuán)去除不完全，導(dǎo)致恢復(fù) 3’-OH 的反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生“小尾巴”，而不是完全復(fù)原成原來的堿基，隨著鏈的延伸，積累的“小尾巴”導(dǎo)致與模板結(jié)合不穩(wěn)，延伸反應(yīng)無法進(jìn)行；
  ② 熒光基團(tuán)去除不完全：加了一個(gè)堿基后，要加下一個(gè)堿基，需要先把前面加的堿基上的熒光基團(tuán)去掉，否則影響下個(gè)堿基的讀取，但往往熒光基團(tuán)去除不完全，會(huì)產(chǎn)生背景，并隨著反應(yīng)進(jìn)行逐漸積累加深，影響熒光信號(hào)讀取的準(zhǔn)確性。
  ③ 測序時(shí)經(jīng)過長時(shí)間的 PCR，會(huì)有不同步的情況。比如一開始 1 個(gè) cluster 中是 100 個(gè)完全一樣的 DNA 鏈，但是經(jīng)過 1 輪增加堿基，其中 99 個(gè)都加入了 1 個(gè)堿基，顯示了紅色，另外 1 個(gè)沒有加入堿基，不顯示顏色。這時(shí)候整體為紅色，我們可以順利得到結(jié)果。隨后，在第 2 輪再加入堿基進(jìn)行合成的時(shí)候，之前沒有加入的加入了 1 個(gè)堿基顯示紅色，剩下的 99 個(gè)顯示綠色，這個(gè)時(shí)候就會(huì)出現(xiàn)雜信號(hào) 。當(dāng)測序長度不斷延長，這個(gè)雜信號(hào)會(huì)越來越多，最后很有可能出現(xiàn) 50 個(gè)紅，50 個(gè)綠色，這時(shí)信號(hào)不足以判斷堿基類型；
  ④ 就是測序過程中 合成酶的活性 越來越不穩(wěn)定，后面堿基添加出現(xiàn)問題。

● Deep Sequencing Technologies

TechnologiesPurposes

RNA-seq (3’ end)	Gene expression profiling
ChlP-seq	DNA-protein interactions
GRO-seq	Nascent RNA production 新生 RNA
CLIP-seq	RNA-protein interactions
RASL-seq (small scale)	Splicing profiling
RASL-seq (large scale)	Large-scale target gene expression
sRNA-seq	microRNA profiling

● RNA-seq for 3’ end (MAPS)

---

8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）

● ABI SOLiD - Sequence by Oligonucleotide Ligation with Dual-base Encoding

• 基板附著雙堿基探針
• 通過剪切和適配器連接制作測序文庫
• 將 DNA 片段連接到珠子上并乳膠 PCR 擴(kuò)增
• 將 DNA 附著到玻片上
  
  三個(gè) N 核苷酸是簡并堿基，可以是 A，C，T 或 G 中的任何一個(gè)。最后三個(gè) Z 核苷酸是可以與四個(gè)核苷酸堿基中的任何一個(gè)配對(duì)的通用堿基。

● SOLiD: Sequencing ligation cycles 測序連接循環(huán)過程

● SOLiD 系統(tǒng)采用雙堿基編碼探針，片段化基因組 DNA 后用乳膠 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，這些步驟和 Roche 454 系統(tǒng)類似。測序引物與模板 DNA 雜交后，啟動(dòng)八核苷酸探針與模板的雜交。從第 n 位堿基開始，用 DNA 連接酶催化連接、采集熒光信號(hào)、切除探針后三位核苷酸及所標(biāo)記的熒光標(biāo)簽三步循環(huán)。簡并八核苷酸探針的第一位和第二位堿基決定探針的熒光標(biāo)記顏色。10 次循環(huán)，產(chǎn)生 10 個(gè)熒光信號(hào)，對(duì)應(yīng) DNA 序列上每 5 個(gè)堿基中的前兩個(gè)堿基序列。10 次循環(huán)后，變性恢復(fù)單鏈模板，選用不同引物，從 n-1 位堿基重新開始 10 個(gè)循環(huán)，以此類推。
● SOLiD 系統(tǒng)的主要錯(cuò)誤在于堿基替換，測序通量最大，讀長較短。

● SOLiD 解碼序列

• 每種顏色表示兩個(gè)堿基。
• 由于每種顏色代表兩個(gè)核苷酸，其中每個(gè)二核苷酸單元的第二個(gè)堿基構(gòu)成下個(gè)二核苷酸的第一個(gè)堿基，因此只要知道序列中的一個(gè)堿基將導(dǎo)致我們解釋整個(gè)序列。

● ABI SOLiD/Life Technology

• 通過連接實(shí)時(shí)測序
• 珠子和乳液 PCR 在載玻片上進(jìn)行
• 2.5 billion reads / run
• 35-75 bases / read
• 100 Gb / run
• 雙熒光標(biāo)簽
• 8 individual channels / flowcell
• 2 flowcells / run
• 14 days for 2x50bp

3 種二代測序技術(shù)的共同特征：循環(huán)陣列方法

• DNA 片斷化
• 測序接頭連接到 DNA 片段上
• 幾種可能的方案產(chǎn)生 PCR 克隆陣列——擴(kuò)增
• 具有熒光標(biāo)記的核苷酸的酶促延伸
• 通過對(duì)陣列成像進(jìn)行循環(huán)讀出

二代測序平臺(tái)的弱點(diǎn)

● 群體效應(yīng)所導(dǎo)致的誤差，因而讀序短

• 化學(xué)反應(yīng)效率不完全：聚合反應(yīng)、鏈終止解封反應(yīng)。
• 光信號(hào)檢測誤差：失去族群同步性、族群光信號(hào)失相

● 二代測序技術(shù)速率限制因素

• 庫的構(gòu)建
• 生物信息學(xué)，海量數(shù)據(jù)的拼接

8.2.3 第三代測序：單分子測序技術(shù)

• 一系列錨定的 DNA 聚合酶分子芯片
• 結(jié)合模板鏈+引物

● Heliscope 一循環(huán)添加堿基 (similar to Solexa)

• HeliScope的主要錯(cuò)誤在于堿基缺失，可以通過使模板鏈變性并去除、對(duì)新合成鏈二次測序來提高準(zhǔn)確性。

● Pacific Biosciences (PACBIO RS) 單分子實(shí)時(shí)測序系統(tǒng) (SMRT)

• Pacific Biosciences
  實(shí)時(shí)監(jiān)測，錨定的 DNA 聚合酶
  能檢測 DNA 修飾 (i.e. methylation)
• 不需要常規(guī)的 PCR 擴(kuò)增步驟，假陽性率大大減少；
• 利用單個(gè) DNA 聚合酶對(duì)天然 DNA 的合成進(jìn)行大規(guī)模平行的、連續(xù)的實(shí)時(shí)觀察，更易發(fā)現(xiàn)稀有變異；
• 測序同時(shí)獲得動(dòng)力學(xué)信息，對(duì) DNA 甲基化等堿基變化直接分析；
• 序列數(shù)據(jù)在幾分鐘之內(nèi)就能產(chǎn)生并能實(shí)時(shí)觀察，對(duì)于傳染病監(jiān)控和分子病理學(xué)尤為重要。
• 測序速度快（體現(xiàn) DNA 聚合酶自身的反應(yīng)速度）
• 測序片段長（DNA 聚合酶的延續(xù)性）
• RNA 測序成為可能（固定逆轉(zhuǎn)錄酶）
• DNA 序列甲基化的檢測（甲基化修飾影響堿基摻入時(shí)間，改變信號(hào)持續(xù)時(shí)間或信號(hào)間隔時(shí)間）

8.3 功能調(diào)控與檢測技術(shù)（沒講）

研究蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白質(zhì)-DNA 相互作用。
科研人員還可以在活細(xì)胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，為認(rèn)識(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工等提供了豐富的技術(shù)支持。

8.3.1 表達(dá)量

8.3.2 酵母單雜、雙雜交系統(tǒng)

8.3.3 各類相互作用技術(shù)

8.3.4 標(biāo)記和熒光成像技術(shù)

---

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的【中科院】分子生物学-朱玉贤第四版-笔记-第11-12讲 基因功能研究技术的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。