結(jié)合并激活熒光染料的適體熒光RNA(FR)已用于對豐富的細(xì)胞RNA種類進(jìn)行成像。然而，諸如低亮度和具有不同光譜特性的染料/適體組合的有限可用性的局限性，限制了這些工具在活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和體內(nèi)的使用。

最近，華東理工大學(xué)朱麟勇及楊弋共同通訊在Nature Biotechnology 在線發(fā)表題為”Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs“的研究論文，該研究開發(fā)了Peppers，一系列單體，明亮且穩(wěn)定的具有熒光RNA，其最大發(fā)射范圍從青色到紅色。Peppers可以對活細(xì)胞中的各種RNA進(jìn)行簡單而強(qiáng)大的成像，而對目標(biāo)RNA的轉(zhuǎn)錄，定位和翻譯的干擾影響非常小。

定量分析單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)及其信使RNA的水平表明，翻譯受正常的酶動(dòng)力學(xué)控制，但具有明顯的異質(zhì)性。該研究進(jìn)一步證明，Peppers可用于通過CRISPR展示對基因組基因座進(jìn)行成像，實(shí)時(shí)跟蹤蛋白質(zhì)-RNA鏈以及進(jìn)行超分辨率成像。總而言之，這些FR將是細(xì)胞RNA實(shí)時(shí)成像的有用工具。

RNA在細(xì)胞中表現(xiàn)出復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)，包括表達(dá)，降解，易位，剪接和其他化學(xué)修飾。因此，非常需要類似于熒光蛋白標(biāo)簽來理解RNA的動(dòng)態(tài)分子生物學(xué)。感興趣的RNA可以通過熒光原位雜交標(biāo)記，或通過標(biāo)記被特定酶識(shí)別的結(jié)構(gòu)基序共價(jià)標(biāo)記。不幸的是，這種技術(shù)需要細(xì)胞固定并且不適用于活細(xì)胞成像。具有工程化基序的RNA可以與熒光蛋白和特定RNA結(jié)合蛋白的融合物拴在一起。例如，MCP，PCP，λN或Cas。

Pepper530 RMFP的特性

在這些方法中，由于未結(jié)合的熒光蛋白融合物自由擴(kuò)散，因此存在顯著的背景熒光，并且每個(gè)RNA最多需要48個(gè)綠色熒光蛋白(GFP)融合物才能獲得最佳信噪比。這種束縛蛋白的沉重負(fù)荷是否會(huì)影響RNA的定位，穩(wěn)定性和行為仍有待確定。盡管存在這些缺陷，MS2系統(tǒng)還是當(dāng)前活細(xì)胞RNA成像的金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛用于研究單分子水平的RNA行為。更直接地，目標(biāo)RNA可以與結(jié)合熒光團(tuán)的RNA適體融合并可視化。

擴(kuò)大FR的光譜范圍

盡管已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這種概念已有好幾年了，但是許多這些熒光團(tuán)和熒光團(tuán)-猝滅劑結(jié)合物在活細(xì)胞中具有顯著著的背景熒光和/或不易擴(kuò)散跨質(zhì)膜。Jaffrey和他的同事率先開發(fā)了GFP的RNA模擬物(RMFP)，它們是與GFP熒光團(tuán)的非熒光類似物特異性結(jié)合并激活其熒光的適體。在活細(xì)胞中，這些熒光團(tuán)顯示出大大減少的背景熒光，突出了RMFP信號(hào)本身。 RMFPs已成功地用于對幾種豐富的細(xì)胞RNA種類進(jìn)行成像，并已被開發(fā)為代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的傳感器。

使用Pepper的CRISPR展示對基因組基因座進(jìn)行多色成像

盡管這些RMFP看上去簡單而有前途，但它們具有顯著的局限性，例如相對較低的亮度，僅綠色的可用性，有限的熱穩(wěn)定性或光穩(wěn)定性或多聚體性質(zhì)，這可能會(huì)阻礙其廣泛用于活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和體內(nèi)的一般成像應(yīng)用，尤其是成像mRNA，其豐度比核糖體RNA和轉(zhuǎn)移RNA低幾個(gè)個(gè)數(shù)量級(jí)。具有改善的細(xì)胞亮度，穩(wěn)定性和最大范圍的熒光發(fā)射最大值(特別是在紅色區(qū)域)的RMFP仍然是理想的，但尚未實(shí)現(xiàn)。

在這里，研究人員開發(fā)了Peppers，一系列單體，明亮且穩(wěn)定的具有熒光RNA，其最大發(fā)射范圍從青色到紅色。Peppers可以對活細(xì)胞中的各種RNA進(jìn)行簡單而強(qiáng)大的成像，而對目標(biāo)RNA的轉(zhuǎn)錄，定位和翻譯的干擾影響非常小。定量分析單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)及其信使RNA的水平表明，翻譯受正常的酶動(dòng)力學(xué)控制，但具有明顯的異質(zhì)性。該研究進(jìn)一步證明，Peppers可用于通過CRISPR展示對基因組基因座進(jìn)行成像，實(shí)時(shí)跟蹤蛋白質(zhì)-RNA鏈以及進(jìn)行超分辨率成像。總而言之，這些FR將是細(xì)胞RNA實(shí)時(shí)成像的有用工具。

參考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0249-1

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的异质性查询需要为连线设定_振奋人心！华东理工大学开发新型的荧光染料，为细胞成像奠定基础...的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。