ELISA原理示意圖詳解.ppt

免疫酶技術及其應用——ELISA 一、實驗目的 了解和掌握免疫酶技術的測定原理。 掌握酶聯免疫吸附測定技術的操作步驟，學會利用競爭ELISA的方法，定量測定抗體或抗原。 了解免疫酶技術在生物學和醫學研究的重要意義及應用價值。 二、實驗原理 免疫標記技術(immunolabelling technique): 是指用熒光素、放射性同位素、酶、發光劑或電子致密物質等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應。 特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位 分類：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術、免疫電鏡技術、免疫膠體金技術和發光免疫測定。 免疫酶技術(enzyme immunoassay)： 是將抗原和抗體的特異性免疫反應與酶的催化反應相結合而建立的一種免疫檢測技術。 就是利用酶標記抗體或抗原，以檢測相應抗原或抗體的一種免疫學標記技術。 酶聯免疫吸附試驗ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) 是一類常用的免疫酶技術。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。 常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP) 堿性磷酸酶(AP)。 ELISA檢測抗原 Ag + Ab* ? Ag-Ab* ELISA檢測抗體 Ab + Ag* ? Ab-Ag* ELISA檢測抗體 Ag + Ab1 ? Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ? Ag-Ab1-Ab2* 競爭ELISA檢測抗原 實驗材料： 羊抗人血清白蛋白抗體(一抗) 已知含量的人血清白蛋白(作標準曲線) 待檢人血清白蛋白 辣根過氧化物酶標記的驢抗羊抗體(二抗) 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液 洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/L PBS 底物溶液：OPD-H2O2 終止液：2mol/L H2S04 酶標反應板(一條/人) 三、操作步驟 包被抗原 抗原用包被液(CBS)稀釋至合適濃度，加入到酶標板中，100μl/孔，放入濕盒中，4℃過夜。 抗原與抗體的預孵育 制作標準曲線： 在稀釋板中，用PBS倍比稀釋標準抗原，每種濃度的抗原最終為50μl，分別在各抗原孔中加入250μl一定濃度的抗體，放入37℃恒溫培養箱中30 min。 待測抗原： 取50μl未知濃度的抗原按照同上操作。 3. 與固相抗原的競爭結合 取稀釋板中預孵育的抗原抗體混合液100μl，加入酶標板的抗原孔中，放入37℃恒溫培養箱中60 min。洗板3次。 4. 酶標二抗的結合 酶標抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放37℃ 30min。洗板3次。 5. 加入底物顯色液(用前再配制，并置棕色瓶內) 每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37℃保溫一定時間。 6. 終止反應 待出現明顯顏色反應(或一定時間)后，加入終止液， 50ul/孔以終止反應。 7. 結果測定 用酶標儀在492nm波長下測定OD值。 以標準抗原的濃度為橫坐標，相應的OD值為縱坐標繪制標準曲線，計算未知抗原的濃度。 四、思考題 在定量測定抗原時，直接ELISA與競爭ELISA有何區別？從理論上分析一下各自的優缺點。 在實際操作中，你認為有哪些因素可以影響定量檢測的結果？(操作中應注意的問題) 實驗設計題：如何用競爭ELISA來定量檢測抗體？ qinfuwang@126.com * 固定OD值 次日，用洗板液洗板3次(將洗板液加入每孔，1min后傾去)，以洗去未包被的游離抗原。 抗原100ul/孔 濕盒中，4℃過夜 酶標板 待測抗原50ul PBS 50ul 50ul 稀釋液 50ul 50ul 100ul 標準抗原 250ul抗體 稀釋板 37℃，30 min 100ul 稀釋板 酶標板 37℃，60 min 洗板3次 * * * * *

總結

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