網(wǎng)易科技訊5月19日消息，未來論壇聯(lián)合科學(xué)、醫(yī)藥、臨床等領(lǐng)域內(nèi)的知名專家打造的“《理解未來》科學(xué)講座：病毒與人類健康-專題科普”的第十期直播中，北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心副主任、北京大學(xué)教授黃巖誼為我們帶來《新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測》的主題分享。黃教授介紹了檢測新冠病毒的技術(shù)方法、原理、結(jié)果判斷及實(shí)際應(yīng)用上的局限性。他表示：新冠病毒的檢測主要分為核酸檢測和抗體檢測，這兩個(gè)檢測方法完全不一樣，目的不同，采樣不同，方法不同，結(jié)果解讀不一樣，適用范圍也不同。分子診斷對(duì)于疾病診斷來說是重要的組成部分。疾病的診斷是一個(gè)復(fù)雜問題，尤其是對(duì)新發(fā)傳染病來說，在已知病原體的情況下分子診斷成為極為重要的指標(biāo)。狹義的分子診斷一般來說就是核酸檢測，包括對(duì)特定核酸片段的定性和定量分析，利用核酸雜交芯片、測序技術(shù)等等做序列分析。如果要拓展成廣義的分子診斷，也許還可以涵蓋其它和傳統(tǒng)病理診斷相對(duì)應(yīng)的分子病理技術(shù)包括抗體檢測等。不過約定俗成，一般情況下我們說分子診斷就是說核酸檢測。在傳染病檢測中，核酸檢測是指檢驗(yàn)樣品中間是否含有特定序列的DNA或者RNA的片段，作為病原微生物存在的證據(jù)。

同時(shí)，他表示：核酸檢測的最常見樣本是鼻咽拭子，采樣需要專業(yè)手法。一個(gè)多月前，華西醫(yī)院提出了用唾液進(jìn)行新冠診斷的可能性。這是一個(gè)比較容易實(shí)現(xiàn)自我采樣的操作。美國FDA也已批準(zhǔn)用在家采集的唾液樣本用于新冠檢測。此外，美國耶魯大學(xué)比較了唾液和鼻咽拭子PCR核酸檢測的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和鼻咽拭子比，唾液采樣的穩(wěn)定性相當(dāng)不錯(cuò)，甚至更好一些。這是一個(gè)很好的起點(diǎn)。

談及抗體檢測，黃巖誼教授表示：抗體檢測的樣本是血或血清，快速檢測試劑盒可以利用膠體金顯色進(jìn)行試紙檢測，類似于驗(yàn)孕試紙。這個(gè)方法的好處是非常簡單、易用、便宜，而且不需要復(fù)雜的設(shè)備，速度非常快。

以下分享的就是黃巖誼的演講全文（有刪減）：

黃巖誼：大家好，我是黃巖誼。我在北京大學(xué)工作，現(xiàn)在是北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心的研究員，副主任；我也是北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心的研究員，北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院教授。我主要從事生命分析化學(xué)的研究，尤其是微量核酸的分析技術(shù)研究，集中在基因測序方法、單細(xì)胞分析和微流控技術(shù)幾個(gè)方向上。應(yīng)未來論壇的邀請(qǐng)，我來給大家聊一聊新冠病毒的檢測問題。

這是2019年12月31日新年鐘聲敲響之前的兩小時(shí)，我在北大拍的照片。湖面結(jié)了冰，未名湖上的反光，是博雅塔上亮著燈。那一天我比較忙，沒有看新聞消息；后來發(fā)現(xiàn)有一個(gè)新聞，在武漢出現(xiàn)了不明原因的肺炎。等我知道這個(gè)消息的時(shí)候可能大家都知道了。我不用微博，所以消息來源總是慢半拍。隨后幾天我們慢慢得到很多新聞消息的推送，我也開始關(guān)心這個(gè)消息，雖然我當(dāng)時(shí)并不知道這個(gè)突發(fā)的情況會(huì)不會(huì)影響到我的生活。大概一周時(shí)間之后，肺炎元兇已經(jīng)確定了，這時(shí)候我開始比較關(guān)注它了。為什么呢？因?yàn)槭且粋€(gè)新型冠狀病毒，雖然我不懂冠狀病毒是什么，但是這里說得到了該病毒的全基因組序列，這個(gè)我就有興趣了，因?yàn)槲沂亲鰷y序研究的科研工作者。當(dāng)我看到從序列來確定病毒的時(shí)候，我想這真是很了不起的。從我看到這個(gè)新聞，到得到最終結(jié)果才過去不到一星期的時(shí)間，這是非常難以想象的快速度，僅僅只用了幾天時(shí)間，我們就確定了新的病原體。

回想一個(gè)病原體的確定過程，如果是一個(gè)新傳染病，該怎么做呢？這從來都不是一件容易的事情。一開始網(wǎng)上傳的消息說是SARS，也是我們常說的非典，再次歸來。這次能夠這么快的發(fā)現(xiàn)它不是SARS，而是個(gè)全新的病毒，還跟SARS很接近，得益于過去十五年左右的時(shí)間內(nèi)，高通量DNA測序技術(shù)的飛速發(fā)展。通常鑒定一個(gè)疾病的病原，要符合所謂的科赫法則。也就是說，首先要找到宿主體內(nèi)的致病微生物，發(fā)現(xiàn)它不存在于健康生物體內(nèi)；要想辦法分離出來，得到它的純培養(yǎng)物，重新接種到宿主體內(nèi)，再次分離得到這個(gè)培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)這個(gè)培養(yǎng)物接種的宿主必定會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，等等。科赫法則是在130年前正式發(fā)表的，到現(xiàn)在為止還主導(dǎo)著絕大多數(shù)傳染病病原體的診斷標(biāo)準(zhǔn)。只不過隨著科技的發(fā)展，在新時(shí)代到來的時(shí)候，隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，很多法則用到了新的病原體鑒定的時(shí)候，有了新的變化。

舉個(gè)例子，比如說肺炎吧，它的癥狀，通常是患者肺泡內(nèi)充滿液體出現(xiàn)氧合不良。肺炎是什么病原體導(dǎo)致的呢？可以說有很多。除了最常見肺炎鏈球菌之外，還有很多病原體可以引起肺炎。比如說這些下圖所示的各種病原體，我從網(wǎng)上查來的，都有可能引起肺炎。

總的來說，分成病毒、細(xì)菌和少數(shù)真菌這三大類。病毒是里面最麻煩的，因?yàn)樗貏e的小。病毒跟人類相伴了很長的時(shí)間，人類文明史上從來沒有間斷過，一直有它的存在，很難對(duì)付。病毒在地球上待的時(shí)間比我們長多了，隨著人類文明的一步一步發(fā)展，它永遠(yuǎn)跟著我們走。現(xiàn)在由于疫苗的大量普及而慢慢少見的脊髓灰質(zhì)炎，也就是小兒麻痹癥，也是花了半個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間才基本根除。幾個(gè)月前看到世界衛(wèi)生組織的新聞，宣布在世界范圍內(nèi)消滅脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型野病毒，這是一個(gè)亞型被完全消滅。病毒難以對(duì)付的一個(gè)原因，是它特別小，它的尺度和肉眼所及的尺度是很不相配的；肉眼是看不到病毒的，數(shù)量級(jí)相差太多了。光學(xué)顯微鏡出現(xiàn)之后大大幫助了生物學(xué)家和病理學(xué)家找病原體，它幫助科赫確定了結(jié)核桿菌、霍亂弧菌這些病原體，但是他沒有辦法用這些工具來發(fā)現(xiàn)病毒這個(gè)病原體，這超出了光學(xué)顯微鏡的極限。直到1939年到1940年間，德國科學(xué)家Ruska第一次在電子顯微鏡下看到了病毒顆粒，有煙草花葉病毒、牛痘病毒等。這不得不感謝大他兩歲的哥哥，他哥哥是電子顯微鏡的發(fā)明人，后來晚年得了諾貝爾獎(jiǎng)。這次我們對(duì)新冠病毒的確定，也多虧了這些新技術(shù)的發(fā)展。

讓我們回到今年一月份。一月下旬，幾篇中國科學(xué)家撰寫的科學(xué)論文相繼面世，使得我們可以全面了解這一個(gè)新的病原體。新聞報(bào)導(dǎo)，只是新聞，但是讀科學(xué)論文，可以感受到細(xì)節(jié)的重要性。首先，1月24日的《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上，我們看到了這個(gè)病毒的全基因組序列。從序列上，生物學(xué)家可以很明確地判斷這是冠狀病毒，而且從序列分析上可以判定這是一個(gè)新病毒，在人類歷史上以前沒有發(fā)現(xiàn)過的新病毒，歸屬到Beta屬，是感染人類的冠狀病毒科的第七個(gè)成員。

上圖是第一次科學(xué)論文中展示新冠病毒的透射電子顯微鏡照片，可以看到它個(gè)頭很小——對(duì)照比例尺，它的大小只有100nm左右，但是長相和其他冠狀病毒非常相似。

同一天，《柳葉刀》雜志上發(fā)表了由中國醫(yī)科院病原所王健偉教授和中日友好醫(yī)院曹彬主任的團(tuán)隊(duì)對(duì)新冠患者的臨床特征的研究結(jié)果。這里第一次提到對(duì)病人確診的時(shí)候使用了一個(gè)技術(shù)，即RT-PCR方法，來進(jìn)行核酸檢測。種種跡象表明這是一種新疾病，給我們帶來了新挑戰(zhàn)；不僅給科學(xué)帶來了新挑戰(zhàn)、給醫(yī)學(xué)帶來新挑戰(zhàn)，也給病人帶來新挑戰(zhàn)。

第三篇重要的論文，是在我們中國自己的期刊《中華醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表的，這篇文章很系統(tǒng)地描述了新冠病毒的特征。在隨后在中國科學(xué)報(bào)的新聞中，可以看到這個(gè)病原鎖定的過程，非常地迅速、高效。幾個(gè)團(tuán)隊(duì)平行行動(dòng)，開始進(jìn)行測序，使得結(jié)果的可靠性大大增加。在血清學(xué)的研究中，還揭示了病毒與患者恢復(fù)期的血清之間的抗原抗體反應(yīng)，這是一篇很完整的科學(xué)論述。

第四篇，是這三個(gè)平行檢測中的另一個(gè)團(tuán)隊(duì)，武漢病毒所的團(tuán)隊(duì)。他們的結(jié)果，和之前其它團(tuán)隊(duì)的一樣，得到了幾個(gè)病毒的全序列。

另外一個(gè)重要結(jié)果是右邊這些彩色的光學(xué)顯微鏡展示（上圖）人的ACE2蛋白是病毒侵犯人體細(xì)胞的重要途徑，這對(duì)于病毒致病機(jī)制研究和治療以及藥物開發(fā)都提供了重要的線索。

第五篇論文是和上一篇同時(shí)發(fā)表的，上海團(tuán)隊(duì)，從早期武漢一個(gè)單個(gè)病人身上獲得樣本，通過高通量測序方法，得到了病毒的全序列，拿它和SARS病毒的序列作了比較。正是由于中國科學(xué)家們?cè)?月份第一周之內(nèi)快速響應(yīng)和高質(zhì)量的工作，很快病毒的參考基因組得到了。通過參考基因組，我們就有了坐標(biāo)系。

首先，可以理解病毒基因組的每一段序列是干什么。比如上圖標(biāo)記出來得道道，就是一個(gè)個(gè)基因，用來編碼一段一段有功能得蛋白，行使特定的功能，有的是讓病毒可以復(fù)制，有的是讓病毒有利于侵入人體，有的是構(gòu)建病毒的結(jié)構(gòu)框架。其次，有了這個(gè)參考坐標(biāo)，以后病毒再發(fā)生了變異，我們就知道什么地方發(fā)生了什么變異，這對(duì)我們更深度的理解病毒生物學(xué)的基本功能，以及它的自然史，以及疾病發(fā)生與發(fā)展有非常重要的意義。

上圖是病毒基因組編碼的主要蛋白質(zhì)，展示的是預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，是美國密歇根大學(xué)張陽教授團(tuán)隊(duì)的結(jié)果。從這里可以看到，這有個(gè)很重要的蛋白，叫做Spike protein（S蛋白），還有別的比如M蛋白、N蛋白等等，這些不同的蛋白是這個(gè)病毒中非常特異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過這些結(jié)果可以構(gòu)建出來，現(xiàn)在經(jīng)常可以在新聞中看到的新冠病毒的模型圖，病毒外表上這些蛋白一般就是我指的這些蛋白，這些蛋白給病毒特定的功能，不僅給它一個(gè)結(jié)構(gòu)支撐，而且對(duì)我們做檢測來說也能成為我們重要的目標(biāo)。我們可以通過檢測這些病毒的特定成分例如目標(biāo)蛋白或者編碼這些蛋白的基因來確定病毒的存在。

正是由于我們對(duì)于病毒的序列的解讀，我們馬上就可以知道它和17年前的宿敵SARS冠狀病毒是近親。都不需要告訴大家怎么看這個(gè)圖，可以看出它們是蠻像的。它不僅和SARS很像，和10年前的MERS也有關(guān)系。這也說明了我們不能小瞧這個(gè)病毒，它可能具有巨大的破壞力。由于與SARS的相似性，國際病毒命名委員會(huì)，將原來我們把它叫做2019新型冠狀病毒改名嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2即SARS-CoV-2。SARS-CoV-2表明它跟原來SARS病毒之間的關(guān)聯(lián)性還是比較近的。前不久德國科學(xué)家的論文也說明這個(gè)新的SARS冠狀病毒和原先的SARS病毒確實(shí)在攻擊細(xì)胞的時(shí)候采用的策略極為相似，通過進(jìn)攻同樣的蛋白來侵入細(xì)胞。而且還發(fā)現(xiàn)之前SARS病毒的抗體對(duì)新病毒也具有一定的中和作用，揭示兩種病毒的高度相關(guān)性。

進(jìn)入生物分子學(xué)的時(shí)代，對(duì)于傳染病的認(rèn)識(shí)開始變化，都從分子水平理解開始。知道了冠狀病毒，就不像2003年那樣，那時(shí)我們一開始還不能確定病原體，叫它非典型性肺炎。現(xiàn)在國際衛(wèi)生組織命名這個(gè)新的疾病為“2019冠狀病毒病（COVID-19）”，即由冠狀病毒感染引起的疾病，而不是用簡單癥狀來命名。我們國家衛(wèi)健委的命名還是“新型冠狀病毒肺炎”。所以大部分時(shí)候我們?cè)谥袊€是用新冠肺炎來稱呼COVID-19。

上圖是香港大學(xué)的科學(xué)家1月份看到的冠狀病毒，這個(gè)病毒已經(jīng)完成了復(fù)制，從細(xì)胞里面釋放出來。

上圖是2月份美國科學(xué)家拍攝的冠狀病毒的大頭照，可以清晰的看到表面“花冠的出現(xiàn)”，這是一個(gè)偽彩照片，很好的標(biāo)出了“花冠”的存在。

前不久美國疾控中心發(fā)布新的冠狀病毒的集體照（如上圖），藍(lán)色標(biāo)出來的是病毒顆粒，病毒顆粒里的小黑點(diǎn)就是切開了的斷面上的核酸，就是這些冠狀病毒里包含了基因組的部分。這個(gè)基因組對(duì)于我們做檢測有極其重要的意義，是我們檢測的物質(zhì)基礎(chǔ)。

分子診斷對(duì)于疾病診斷來說是重要的組成部分，疾病診斷是復(fù)雜問題，尤其是新疾病出現(xiàn)的時(shí)候，對(duì)于一個(gè)傳染病來說，已知病原體的情況下分子診斷成為極為重要的指標(biāo)。它的主要目的有以下幾個(gè)：第一，它確定臨床癥狀，比如發(fā)燒是否是由新冠病毒引起的，避免它和其他疾病混淆起來。第二，對(duì)疾病的進(jìn)程進(jìn)行定性（比如陽性陰性）或者定量描述，比如病毒載量的多少。第三，從更加精細(xì)的角度出發(fā)，某些分子診斷還可以提供疾病的治療方案，幫助確定它的方案，提供證據(jù)的支撐。第四，從病毒疾病的角度出發(fā)，可以追蹤變異情況，這也非常重要，研究并且預(yù)測病毒在傳播過程中的傳染和致病能力的演化，比如我的同事北京大學(xué)陸劍老師的文章，他指出有一些關(guān)聯(lián)性特別密切的突變位點(diǎn)，很可能和疾病的愈后之間有著非常緊密的指征性連接，所以很可能對(duì)以后疾病的救治，以及理解病毒怎么跟宿主共同生存有很重要的意義。

什么是分子診斷？狹義的分子診斷一般來說就是核酸檢測，包括對(duì)特定核酸片段的定性和定量分析，利用核酸雜交芯片、測序技術(shù)等等做序列分析。如果要拓展成廣義的分子診斷，也許還可以涵蓋其它和傳統(tǒng)病理診斷相對(duì)應(yīng)的分子病理技術(shù)包括抗體檢測等。不過約定俗成，一般情況下我們說分子診斷就是說核酸檢測。核酸檢測是指檢驗(yàn)樣品中間是否含有特定序列的DNA或者RNA的片段，作為病原微生物存在的證據(jù)。除了病原微生物的分子診斷外，這一方法在疫情之前就已經(jīng)被用的很普遍了，比如說大量的其他感染性疾病的診斷、遺傳疾病的診斷、腫瘤的分型、化療用藥的指導(dǎo)等很多醫(yī)療實(shí)踐中都用到核酸，只不過那時(shí)候沒有像今天提的這么多而已。

除此之外我們針對(duì)抗體做檢測就是抗體檢測，抗體檢測看的不是病毒本身，而是看血液中間或者體液中間有沒有抗體分子的出現(xiàn)。

還有一種檢測是抗原檢測，目標(biāo)是病毒身上的物質(zhì)，比如我們上圖中看到的藍(lán)色標(biāo)記的這兩個(gè)地方，這兩個(gè)都是病毒獨(dú)有的蛋白，刺突S蛋白和核衣殼N蛋白，看他們是否存在于樣品中，就是抗原檢測。這都是基于我們要檢測的時(shí)候的物質(zhì)基礎(chǔ)。

檢測，歸根到底是針對(duì)分子的測量，測量分子數(shù)量的多少；這是由病毒本身的結(jié)構(gòu)和組成來決定的，都有其物質(zhì)基礎(chǔ)。這幾位以色列和美國的科學(xué)家，把冠狀病毒的一些關(guān)鍵數(shù)據(jù)列了出來。從檢測上講，除了核酸分子（上圖中綠色箭頭標(biāo)出來的），它是每個(gè)病毒里有一條分子外，還有很多蛋白質(zhì)分子（幾個(gè)紅色箭頭標(biāo)出來的），在病毒里數(shù)量很多。但是這些分子的數(shù)目分布還是有區(qū)別的，S蛋白，大概每個(gè)病毒有上百個(gè)；N蛋白和M蛋白每個(gè)病毒有上千個(gè)。對(duì)這些數(shù)量的了解非常有助于我們今后發(fā)展特異性的檢測技術(shù)來確定病毒的存在。

從新冠病毒肺炎的第七版診療方案中可以看到，診斷指標(biāo)列的非常明確，在病原體上的證據(jù)有兩項(xiàng)，一是熒光RT-PCR，二是基因測序。病毒的核酸序列特征和其他物種比如動(dòng)物和人的核酸序列大不相同，通過這兩個(gè)方法可以對(duì)序列鑒別不太容易出錯(cuò)。隨著疫情的發(fā)展以及我們對(duì)病毒自然史認(rèn)識(shí)的加深，診療方案調(diào)整到后期的時(shí)候，把血清學(xué)檢測也加上了，我們以后再講。

關(guān)于檢測，國家衛(wèi)健委的通報(bào)和藥監(jiān)局的審批一直都是圍繞核酸和抗體進(jìn)行。這兩個(gè)檢測方法完全不一樣，目的不同，采的樣品來源不同，檢測方法不同，結(jié)果解讀不一樣，適用范圍也不同。下面稍微介紹一下這兩個(gè)方法。

核酸檢測，首先是采樣。

現(xiàn)在接受核酸檢測的人多了，大家看的新聞也多了，看到上圖這樣的圖片不會(huì)覺得太新鮮了。事實(shí)上我自己去年以前沒有體驗(yàn)過咽拭子是怎么回事兒。更多人只是在圖片上看到過這樣的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，并沒有真正的體會(huì)過。真實(shí)過程比圖片展示的可能還要復(fù)雜一些。采樣，一般都在實(shí)驗(yàn)室外相對(duì)空曠的地方，采樣人員必須經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，還要注意防護(hù)。因?yàn)檫@是有風(fēng)險(xiǎn)的操作，不僅僅面對(duì)有可能帶傳染能力的感染者，還包括采樣過程中本身會(huì)增加暴露的風(fēng)險(xiǎn)。比如采樣中打個(gè)噴嚏或者咳嗽，都會(huì)增加暴露風(fēng)險(xiǎn)。

要確保采樣成功有兩個(gè)關(guān)鍵，一個(gè)是使用的材料即拭子是有講究的，不是隨便一個(gè)棉簽就可以；同時(shí)，拭子采樣后的保存環(huán)境也是有講究的。另外采樣本身的操作是有講究的，手法也重要，也不能過去一捅就能夠采到。采樣的部位選擇和操作都是獲取高質(zhì)量樣本的基礎(chǔ)，只有樣本質(zhì)量好，才有可能做出可靠的檢測。舉個(gè)例子，最常見的樣品就是鼻咽拭子，注意采樣的拭子要一直伸到鼻咽部的最后面，在口咽部的上方。這不是一個(gè)很容易的操作，很講究經(jīng)驗(yàn)和手法，自己做也是有困難的，一般也不推薦自己這么采樣。還有喉咽拭子，張開嘴，也是要將很長的拭子深入到口腔后部，在咽喉部位，扁桃體邊上。這個(gè)取樣也不是自己可以簡單做的，通常還要把舌頭壓下去。為什么采樣這樣講究？因?yàn)椴蓻]采到、采沒采好，直接決定了你做的檢測到底能不能看到可靠的結(jié)果。

采樣部位的不同反映在檢測結(jié)果上也不一樣，中國科學(xué)家們很早就總結(jié)了一些規(guī)律。

比如，從上圖a，看得出來隨著癥狀的進(jìn)展，慢慢的好像信號(hào)就下去了。隨著（出現(xiàn)癥狀之后）時(shí)間增加，采樣得到的核酸數(shù)量越來越少。另一個(gè)結(jié)果，從c圖上可以看到鼻咽拭子采到的核酸量會(huì)比喉咽拭子高一些，穩(wěn)定性也稍微好一些。早期得到的經(jīng)驗(yàn)對(duì)后面指導(dǎo)采樣的流程有重要的意義，就是應(yīng)該怎么采、采什么地方的樣品。

疾病的特點(diǎn)導(dǎo)致了病毒侵染部位有特點(diǎn)，既有偏好，也受發(fā)病時(shí)間的影響。實(shí)際上，作為檢測，可以用各種樣品，不僅僅只是兩種拭子。第七版的診療方案中明確提出了鼻咽拭子、痰、其他下呼吸道分泌物、血液、糞便的標(biāo)本中都可以測出病毒核酸。還有調(diào)查研究表明，這么多的論文總結(jié)起來，看上去在很多樣品中比如眼淚、糞便中都可能檢測到核酸病毒，但這里面痰液或下呼吸道分泌物是最不容易漏檢的，也就是檢出率是最高的，接下來就是鼻咽拭子。所以可以發(fā)現(xiàn)真正做高質(zhì)量的測量研究中，對(duì)樣品的來源非常考究，要求一定要保證樣品采樣的質(zhì)量，只有拿到好的樣品才可能得到好結(jié)果。世界衛(wèi)生組織在1月份就有指導(dǎo)文件，對(duì)不同樣品的采集、保存、用途都做了很好的梳理，有了這樣的指南，世界各地的科研人員和醫(yī)務(wù)人員都可以遵循相對(duì)正規(guī)可靠的流程，來保證結(jié)果的可靠性。

樣品采集后做檢測，第一步通常是核酸提取，就是把樣品中的核酸部分留下，其他部分雜質(zhì)、人脫落的細(xì)胞、其他分子如蛋白質(zhì)分子等等都除掉。通常的核酸提取，采用的都是把核酸分子用和它親和力強(qiáng)的材料，例如硅膠等，先吸附；等到把其它物質(zhì)都分離掉后，在把吸附的核酸分子洗脫下來，實(shí)現(xiàn)了提取，同時(shí)也是純化和富集的步驟。這里可以采用的，在實(shí)驗(yàn)室里面，有兩個(gè)方法。這兩個(gè)方法現(xiàn)在在新冠病毒的核酸檢測中，都廣泛使用。要么使用硅膠膜來吸附，要么利用表面修飾的磁性小顆粒來實(shí)現(xiàn)吸附。這個(gè)步驟看上去很簡單，但是這里最關(guān)鍵的一點(diǎn)，是要考慮到生物安全。有興趣的觀眾，可以看中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院的培訓(xùn)教學(xué)視頻，這個(gè)視頻完整的演示了怎么做核酸提取，也強(qiáng)調(diào)了操作人員的生物安全問題。為了保證這一點(diǎn)，特別指出所有樣品在操作前要先置于56度的水浴箱里進(jìn)行30分鐘滅活，使病毒失去感染能力。國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南》也說，未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作需要這么做，應(yīng)當(dāng)保持在生物安全二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。

上圖美國CDC的卡通圖。生物安全三級(jí)，簡單說是在封閉空間在采用負(fù)壓，所有的空氣跟其他物質(zhì)不會(huì)沒有經(jīng)過處理直接外排到外界，這樣一個(gè)生物實(shí)驗(yàn)環(huán)境。里面的人員和我們常在電視里看到的全副武裝的白衣戰(zhàn)士差別不大，都是一樣的裝束，只會(huì)更加嚴(yán)格，需要完全沒有暴露的身體部位。生物二級(jí)要求沒有那么嚴(yán)格，空氣和外界有交換，有時(shí)在個(gè)別區(qū)域可以增加生物安全等級(jí)，做要求更高的實(shí)驗(yàn)。這次吳晨老師帶領(lǐng)的武漢的方艙檢測國家隊(duì)，就是在一個(gè)移動(dòng)的生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室工作的。

上圖是吳晨教授在武漢現(xiàn)場工作的照片。左邊的工作環(huán)境是生物安全二級(jí)，右邊那個(gè)車是移動(dòng)的生物安全三級(jí)的實(shí)驗(yàn)室，吳晨老師的打扮是標(biāo)準(zhǔn)的生物安全三級(jí)的打扮，如果不是有名字寫在那里，其實(shí)你并不知道她是誰。全副武裝做實(shí)驗(yàn)，是出于生物安全的考慮。

核酸提取之后是擴(kuò)增的步驟，這是通過廠家提供的幾管試劑實(shí)現(xiàn)的。上圖中左邊是華大基因的試劑，里面是幾個(gè)小試管，右邊是美國疾控中心分發(fā)的試劑，里面也是幾個(gè)小試管。檢測的過程叫做RT-PCR，就是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這是一個(gè)利用自然中存在的核酸復(fù)制機(jī)制來實(shí)現(xiàn)DNA分子的體外復(fù)制的操作，已經(jīng)發(fā)明了近四十年，是分子診斷的基礎(chǔ)技術(shù)，也是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)進(jìn)步的重要奠基性技術(shù)。在每一個(gè)試管中，除了加待測樣品就是核酸提取液外，還要加DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，以及引物和探針。新冠病毒是RNA病毒，病毒里面包裹這一條基因組RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶把這條RNA變成和它互補(bǔ)的DNA，然后再復(fù)制一遍，變成雙鏈DNA，再往后就可以通過熱循環(huán)一遍一遍的解開配對(duì)的雙鏈，分別復(fù)制。1變2、2變4、4變8，經(jīng)過N輪循環(huán)，理論上可以得到幾何級(jí)數(shù)增長的特定片斷的DNA。在復(fù)制的過程中，一個(gè)巧妙設(shè)計(jì)使每一次的復(fù)制能產(chǎn)生特定的熒光分子，復(fù)制的分子越多產(chǎn)生的熒光越多，我們就可以檢測到這信號(hào)，這樣一輪一輪的復(fù)制下去，我們看熒光增長。如果有熒光增長就是有待測物質(zhì)，即所謂陽性；沒有增長就是沒有待測物質(zhì)即所謂的陰性。熒光增長越快，就說明分子越多，增長越慢，說明分子越少，大概就這樣一個(gè)過程。

這個(gè)過程歷時(shí)不太長時(shí)間，能夠給出這樣一個(gè)圖來（如上圖），劃一條線切過去，與熒光強(qiáng)度曲線交叉得到的值如果是低的證明你可能是陽性，這個(gè)值太高了或者沒有出現(xiàn)（上升）證明是陰性。

這個(gè)判斷在實(shí)際上還是有講究的，做的過程中一定要加質(zhì)控品，陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控都要有。一般來說陰性的就是純凈的水，里面不應(yīng)該有待測的核酸，不應(yīng)該出信號(hào)；如果出了信號(hào)，這次實(shí)驗(yàn)的可靠性就有問題。陽性的，一般是一個(gè)低濃度的樣品，如果我們沒有測出信號(hào)，證明這次實(shí)驗(yàn)不夠靈敏，也許哪里有問題了，需要檢查和重做。

另外，選擇探針序列也就是引物序列非常講究，在大概3萬個(gè)堿基左右長度的序列，檢測哪一段還是需要下一番功夫的。一組韓國科學(xué)家，前不久發(fā)表了一個(gè)對(duì)比結(jié)果，把一月份就分別采用的核酸檢測的檢測位點(diǎn)，的有效性做了一個(gè)相對(duì)客觀的比較。各國科學(xué)家確定的用來做診斷的位點(diǎn)，是有區(qū)別的。上面這里，我標(biāo)出了這些檢測的核酸片段在基因組中的位置，比如中國的兩個(gè)位點(diǎn)，一個(gè)是ORF1ab，另一個(gè)是N；而美國的三個(gè)，都在N蛋白基因上；德國的，一個(gè)在RdRp基因上，一個(gè)在E基因上。

上圖是N基因的一段序列，里面用顏色表示的是，各個(gè)國家檢測的位點(diǎn)，所使用引物的位置。可以看出，少量位置，各個(gè)國家的科學(xué)家們確定的有一些小的重疊，但是總的來說，并不是精確在一起。結(jié)果很有意思，韓國科學(xué)家的對(duì)比實(shí)驗(yàn)提出來中國和美國選擇的位點(diǎn)是這些檢測中靈敏度最高的，這也從側(cè)面反映了我們科學(xué)家早期選擇位點(diǎn)的時(shí)候選的很準(zhǔn)，這是需要經(jīng)驗(yàn)的，需要能力，也需要做出科學(xué)判斷的。

核酸檢測是否還可以改進(jìn)？首先看速度，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的核酸檢測過程，取樣是很快的，然后把它存到運(yùn)送培養(yǎng)基里，把樣品攢到一定數(shù)量的時(shí)候，集中滅活，56度、30分鐘，然后進(jìn)行核酸提取；核酸提取差不多30-90分鐘，PCR反應(yīng)40-60分鐘，這個(gè)是可以一批樣品，常常96個(gè)一起做的，出來之后可以快速結(jié)果判定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)做下來大概小半天的樣子。這個(gè)過程能不能加速？如果是單個(gè)樣品，樣品采集之后直接就做，可以跳過很多步驟，比如直接放到裂解液里面，然后做快速的核酸提取，甚至不做提取就做快速的PCR，這樣可能在30分鐘左右就拿到結(jié)果。可以看到，PCR檢測本身是可以做到快速的，尤其是樣品量少的時(shí)候可以這么做，但樣品多的時(shí)候最好是一批一批地操作更有效率。

我后面還會(huì)講到一些檢測方法，我們先看一下前幾天美國科學(xué)家的一個(gè)綜述，把最近報(bào)道的各種核酸檢測方法做了一個(gè)總結(jié)。

上圖可以看到，各種方法檢測所需的時(shí)間，大部分在一兩個(gè)小時(shí)內(nèi)都能做完，價(jià)格從幾美元到十幾美元。這里方法很多，有的已經(jīng)不再是所謂RT-PCR方法，但還是充分借用了大自然的力量，利用自然界遺傳物質(zhì)的復(fù)制機(jī)制，進(jìn)行特定的DNA片段的擴(kuò)增，最終達(dá)到足夠強(qiáng)的信號(hào)獲取。擴(kuò)增反應(yīng)本身可以通過各種巧妙的方法加以實(shí)現(xiàn)。除了RT-PCR這一被反復(fù)驗(yàn)證和優(yōu)化了20多年，被證明為極為可靠的臨床檢驗(yàn)方法之外，還有很多其他擴(kuò)增方法被發(fā)明出來，面對(duì)新冠病毒的檢測這些方法正在經(jīng)受嚴(yán)格的考驗(yàn)。基于對(duì)檢測速度的追求，即使是通過RT-PCR方法，為了減少操作上的技術(shù)壁壘和失誤，可以采用所謂POCT的設(shè)備，也就是可以在現(xiàn)場使用的小型儀器裝置。

上圖中的兩個(gè)是3月下旬的時(shí)候美國藥監(jiān)局最早批準(zhǔn)緊急使用的兩個(gè)儀器，分別可以在30分鐘或45分鐘內(nèi)完成從樣品到結(jié)果的檢測全流程。在傳染病流行期間利用這樣的設(shè)備至少有兩個(gè)重要好處，一個(gè)是分散處理病人檢測需求，避免樣品積壓和運(yùn)送困難。二是可以采用幾乎全封閉的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，減少了操作者的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

上圖的儀器可能是這一類檢測儀器中最出風(fēng)頭的，這是美國超級(jí)銷售特朗普親自帶貨的小儀器，很可惜他沒有擺對(duì)，圖中不是正確的擺放方法。這個(gè)機(jī)器可以在5分鐘之內(nèi)給出陽性結(jié)果，十幾分鐘給出陰性結(jié)果，真正使用的時(shí)候整體所花的時(shí)間實(shí)際上會(huì)再長一些。要說明的是，這不是一個(gè)新的發(fā)明，不是有了新冠病毒突然就冒出了這么一個(gè)新發(fā)明。這個(gè)儀器已經(jīng)在市面上很長時(shí)間了，在被新東家雅培買走之前，它已經(jīng)是市場上用來檢測流感病毒微生物的便攜設(shè)備。

比如上圖，這篇2014年深圳福田醫(yī)院的科研人員參與的一篇論文，就是在評(píng)價(jià)這個(gè)儀器檢測流感的表現(xiàn)。這個(gè)儀器用的基本技術(shù)是一個(gè)相對(duì)冷門的擴(kuò)增方法，叫做NEAR（切口酶擴(kuò)增反應(yīng)），自然界存在很多奇奇怪怪的酶，可以做很多事情。切口酶就是在DNA切面上形成一個(gè)小切口，然后讓聚合酶找到那個(gè)地方，可以開始做復(fù)制，不斷的形成切口，不斷的復(fù)制。這是非常巧妙的一個(gè)方法，不需要做PCR反應(yīng)和熱循環(huán)，屬于等溫?cái)U(kuò)增的一種。等溫?cái)U(kuò)增的意思，是不需要做熱循環(huán)，擴(kuò)增過程在一個(gè)恒定的溫度下進(jìn)行，好處是這個(gè)過程變得非常簡單；另一個(gè)好處是快，因?yàn)榈葴財(cái)U(kuò)增的檢測常常都是幾分鐘、十幾分鐘的時(shí)間尺度下完成的。除了NEAR之外，還有很多等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可以利用在核酸的檢測上。例如一個(gè)相對(duì)比較有名的LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，這是日本科學(xué)家Notomi等人在2000年左右發(fā)明的，這個(gè)方法也是用四個(gè)或者六個(gè)引物序列加到待測物質(zhì)里面，把它的溫度稍微升一點(diǎn)，通常會(huì)在60度左右的溫度下做等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，不需要很復(fù)雜的儀器很快就能做完。這個(gè)方法的一個(gè)好處是，設(shè)備可以做的很簡單，可以很容易操作，肉眼就可以做判別。中國藥監(jiān)局也批準(zhǔn)了基于這類反應(yīng)的體外診斷試劑，例如這是成都博奧晶芯做的基于LAMP擴(kuò)增方式的新冠病毒診斷設(shè)備。

還有其他方法，其中一個(gè)方法是RPA，也是相對(duì)比較容易。它用兩種酶的組合，重組酶和聚合酶放在一起，通過一個(gè)很復(fù)雜的循環(huán)，實(shí)現(xiàn)核酸分子的擴(kuò)增，雖然復(fù)雜但是非常高效，非常快。基于RPA，在美國波士頓有名的華裔青年科學(xué)家張鋒，把它和基因編輯結(jié)合在一起，嫁接起來實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA的檢測，他們起了一個(gè)名字叫SHERLOCK（福爾摩斯的大名）還用這個(gè)名字注冊(cè)了企業(yè)，來做這個(gè)試劑的開發(fā)。無獨(dú)有偶，在美國加州舊金山，基于LAMP方法，嫁接基因編輯，Jennifer Donna跟她的合作者一起也做了一個(gè)新方法，叫做DETECTR，成立的公司叫做Mammoth Biosciences。這兩個(gè)方法比較上看，它們大概都可以實(shí)現(xiàn)30分鐘到50分鐘的檢測，相對(duì)都是快的。這兩個(gè)方法可以用試紙條的形式來讀取結(jié)果，也很容易被大家所領(lǐng)會(huì)，不需要復(fù)雜儀器。

除了縮短時(shí)間，對(duì)于大規(guī)模的檢測，提高檢測通量是非常重要的，試劑盒可以拿來一盒就可以做好多檢測，但是樣品要一個(gè)一個(gè)測。還有核酸提取這樣原來特別消耗體力而且需要經(jīng)驗(yàn)、技巧、訓(xùn)練的工作，最好交給不知疲倦、不容易犯錯(cuò)的機(jī)器來操作。所以我們看到核酸提取自動(dòng)化儀器大量出現(xiàn)在檢測現(xiàn)場，這樣的儀器遍布在各個(gè)定點(diǎn)醫(yī)院，各級(jí)的疾控中心。

上圖右邊這兩個(gè)儀器是在美國的大學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，現(xiàn)在大學(xué)實(shí)驗(yàn)室大量加入到大規(guī)模檢測的隊(duì)列中來，能夠消除一些檢測滯后的焦慮。如果是一個(gè)集中處理的大型檢測結(jié)構(gòu)，就要用更加完整的自動(dòng)化的儀器才好用。

上圖是羅氏公司做的巨無霸儀器，Cobas8800，一臺(tái)這樣的機(jī)器，一天不停機(jī)大概可以完成3000個(gè)核酸檢測，而且?guī)缀跞詣?dòng)，把樣品放進(jìn)去之后就開始做。這有什么好處呢？除了快之外，還有一個(gè)重要的好處是可以保證在世界上不同地點(diǎn)，大家取得的結(jié)果都是基本可靠和穩(wěn)定的。這樣，在基礎(chǔ)比較薄弱、積累不夠雄厚的地方，一樣可以實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)的大規(guī)模檢測。在肯尼亞、在加拿大、在美國、在中國，得到檢測結(jié)果不會(huì)由于操作問題而出現(xiàn)大的偏差。

隨著疫情進(jìn)展，越來越多的檢測需求出現(xiàn)了。隨著居家隔離變成常態(tài)，自我檢測、自我采樣能不能可行？在美國第一個(gè)獲得藥監(jiān)局批準(zhǔn)的居家自助采樣試劑盒產(chǎn)品是LabCorp公司的產(chǎn)品Pixel，它用棉簽在鼻腔中抹一下，然后寄回到檢測中心做大規(guī)模檢測，這樣就不需要做很復(fù)雜的采樣。目前，還沒有看到大規(guī)模的評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)出現(xiàn)。但是畢竟拿棉簽捅鼻子，是不太容易做到很好的穩(wěn)定性的，所以一個(gè)多月前，華西醫(yī)院的科研人員提出了用唾液進(jìn)行新冠診斷的可能性。這是一個(gè)比較容易的自我采樣的操作。不到一個(gè)月前，美國耶魯大學(xué)的科學(xué)家發(fā)表了一篇論文，比較了唾液和鼻咽拭子PCR核酸檢測的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和鼻咽拭子比，唾液采樣的穩(wěn)定性相當(dāng)不錯(cuò)，甚至更好一些。另外更有意思的是絕大多數(shù)患者上看到的結(jié)果，唾液中檢測的病毒更多一些，結(jié)果可能更加準(zhǔn)確，減少假陰性的出現(xiàn)。這是一個(gè)很好的起點(diǎn)，所以前幾天美國新澤西的Rutgers大學(xué)以及他們下屬的檢測機(jī)構(gòu)獲得了美國藥監(jiān)局的批準(zhǔn)，開始使用唾液采集的樣品來進(jìn)行新冠病毒的檢測。他們采用了一個(gè)流水線式的大規(guī)模處理的自動(dòng)化機(jī)器，可以每天檢測1萬份樣本。唾液采樣檢測是非常令人鼓舞的新方法，如果得到推廣有望很好地解決我們過去采樣中的面臨的問題。

隨著疫情的第一個(gè)高峰過去，復(fù)工復(fù)學(xué)的階段到來，抗體檢測成為新的流行語。抗體檢測是如何進(jìn)行的？我發(fā)現(xiàn)前面九期都是跟這些問題相關(guān)的講座，大家肯定已經(jīng)比我更加清楚什么是抗體了。所以我就從技術(shù)上講講抗體檢測是怎么做的。

首先樣本大不一樣，都是用血或者血清進(jìn)行的檢測。抗體檢測的方法多種多樣，最常見的就是酶聯(lián)免疫吸附和免疫化學(xué)發(fā)光法。這兩個(gè)方法的原理非常像，也是實(shí)驗(yàn)室研究最常見的檢測方式。以酶聯(lián)免疫吸附檢測原理為例，在檢測基底上我們先鋪一層人工制備的抗原，然后把血清樣品加進(jìn)去，孵育一段時(shí)間后，特異性結(jié)合到抗體上；然后我們把它洗脫，留下特異性結(jié)合的抗體；這時(shí)候加入酶標(biāo)記的二抗，二抗能夠識(shí)別免疫抗體，它上面還帶催化作用的酶；然后再孵育一段時(shí)間，洗脫后留下特異性的二抗，加入一個(gè)底物會(huì)發(fā)生酶催化，從而導(dǎo)致顯色反應(yīng)的發(fā)生，使得溶液的顏色深淺發(fā)生變化。最終我們用產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)的濃度，推導(dǎo)出你想檢測的抗體的濃度。這種方法，原理簡單，特異性通過抗體識(shí)別來保證，不需要特別復(fù)雜的操作，可以自動(dòng)化或者半自動(dòng)化，實(shí)驗(yàn)通量不低。從這些孔中，顏色的深深淺淺，就可以算出抗體的多少。所以，這是一種定量的方法，也具備大規(guī)模篩查的能力。醫(yī)院里使用的化學(xué)發(fā)光法和這個(gè)原理比較像，只不過檢測的信號(hào)不太一樣。

另外一個(gè)方法是利用膠體金顯色進(jìn)行的試紙檢測方法，檢測是否懷孕的試紙用的也是類似的方法。這個(gè)方法的好處是非常簡單、易用、便宜，而且不需要復(fù)雜的設(shè)備，速度非常快。

上圖是試紙條的結(jié)構(gòu)：樣品墊、膠體金結(jié)合墊、醋酸纖維素膜和吸收墊。如果要檢測的樣品包括你想檢測的抗體，比如新冠病毒的抗體IgM或者IgG，將樣品送入試紙，這時(shí)候在膠體金結(jié)合墊上有金標(biāo)抗原、金標(biāo)單抗，即膠體金聯(lián)合的抗原和單抗，一起向質(zhì)控線方向流動(dòng)，金標(biāo)單抗會(huì)結(jié)合到金標(biāo)單抗的抗體上，作為質(zhì)控的結(jié)果。如果這個(gè)樣品里面有這兩個(gè)待測抗體，它就會(huì)加到這兩個(gè)檢測線上，同時(shí)由于它能夠吸附金標(biāo)抗原，所以會(huì)顯色。如果顯色了，就知道是否樣品中存在待測抗體。如果IgG這條線很深，就知道有IgG；而IgM這條線顯色非常淺，可以認(rèn)為也許沒有這個(gè)抗體，這個(gè)結(jié)果能夠很簡單地看懂。

為什么要做膠體金顯色檢測，是因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)可以應(yīng)用于大規(guī)模篩查。很多地方要調(diào)查感染率，如果感染率高，多數(shù)人有抗體，那這個(gè)病毒就不容易傳播。如果感染率很低，大多數(shù)人沒有抗體，病毒就很容易傳播，這是為了更好地預(yù)防下一次的流行。

那么做了檢測就能得到想知道的結(jié)果嗎？這需要非常認(rèn)真地思考，因?yàn)闆]有一個(gè)方法是完美的。分子檢測從來都不是完美的，這世界上沒有完美的檢測方法。要了解每一種檢測方法的優(yōu)勢和缺點(diǎn)，以便更好地選擇和判斷。

首先，檢測的時(shí)間點(diǎn)非常重要。

上圖是前幾天《美國醫(yī)學(xué)會(huì)志》上刊登的一個(gè)示意圖。不同的檢測對(duì)象和疾病進(jìn)展間的關(guān)系有很大不同。病毒在發(fā)病前幾天才容易分離出來，那時(shí)候核酸載量是不多的。核酸檢測能檢測到嗎？咽拭子或者肺泡的灌洗液要比糞便檢測容易一些，但是糞便可能存在的時(shí)間長一些，后期更容易檢測出來。抗體都是在發(fā)病后期才出來的，IgM抗體衰退比較快，IgG抗體衰退的慢，停留的時(shí)間會(huì)長一些。所以選擇什么樣的檢測方法，跟時(shí)間節(jié)點(diǎn)有極其重要的關(guān)聯(lián)性，每一個(gè)方法有極限。我們?cè)诜治鲋薪?jīng)常用檢出限來表示檢測方法的靈敏度，檢出限就是在給定的置信度條件下可以從被測樣品中檢測待測組分的最小濃度或者最小量。比如基因編輯方法檢測技術(shù)跟傳統(tǒng)的計(jì)算方法比，檢出限比傳統(tǒng)的RT-PCR方法高一個(gè)量級(jí)左右。實(shí)際上現(xiàn)在大量使用的RT-PCR的檢測限非常低，也就是說檢測的敏感性非常高，大概在一個(gè)反應(yīng)能夠檢測幾個(gè)核酸片斷的存在。絕大多數(shù)其它檢測方法，快的也好、慢的也好，不見得敏感性更好。

另外，要考慮一個(gè)檢測方法的特異性是否真的很好。核酸檢測中特異性取決于引物選擇的位置、引物序列與目標(biāo)核酸的匹配，還要考察是否真的能檢測出來。來自香港科學(xué)家的這篇發(fā)表在《臨床化學(xué)》的研究論文表明，兩個(gè)核酸檢測位點(diǎn)總，有一個(gè)位點(diǎn)明顯比另一個(gè)更加容易檢測出來，具體說就是N蛋白基因比ORF1b更容易檢測出來，雖然一開始設(shè)計(jì)上看好像這兩個(gè)位點(diǎn)的表現(xiàn)都差不多，但是真正使用的時(shí)候是有區(qū)別的。

雖然方法都不是完美的，但是它也有一定的可取之處，只要用的妥當(dāng)，找到號(hào)的適用場景。舉個(gè)例子，比如在人群中35個(gè)健康人、35個(gè)感染者，我現(xiàn)在做一個(gè)檢測，檢測的陽性結(jié)果35個(gè)，大家認(rèn)為這是很不錯(cuò)的結(jié)果，是吧？但事實(shí)卻不是這樣。檢測到的35個(gè)病人并不是真正的感染者。結(jié)果可以分成四塊：真實(shí)感染者檢測出來了，是真陽性；健康人被算成感染者，是假陽性；健康的人檢測出來健康，是真陰性；感染者未被檢測出來，是假陰性。所以真陽性、假陽性、真陰性、假陰性加在一起構(gòu)成了整個(gè)檢測樣本的總數(shù)。

怎么評(píng)價(jià)？第一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)：敏感性。所有的陽性樣本中到底檢測出幾個(gè)陽性？分子是真陽性，分母是真陽性和假陰性的和。結(jié)果25個(gè)真陽性，10個(gè)假陰性，所以是71%的敏感度。

另一個(gè)指標(biāo)：特異性，也就是陰性的樣本中有多少個(gè)真陰性。真陰性和假陽性一起當(dāng)分母，而分子是真陰性。結(jié)果是25個(gè)真陰性，10個(gè)假陽性，一除還是71.4%。準(zhǔn)確度，就是真陽性和真陰性的個(gè)數(shù)加起來除以總數(shù)，這樣算也是71.4%。很多場合我們都關(guān)心陽性結(jié)果是否真的是陽性？這就是所謂的陽性預(yù)測值（PPV），就是說當(dāng)你看到檢測結(jié)果，真陽性和假陽性都是陽性，但是其中多少個(gè)是真陽性呢？這個(gè)例子中，25個(gè)真陽性，10個(gè)假陽性，PPV也是71.4%。也就是說測10個(gè)人大概有7個(gè)真陽性的，另外3個(gè)是假陽性。

剛才我舉了一個(gè)非常奇怪的例子，可以看到很多數(shù)值算出來都是相同的，一個(gè)原因是由于例子中假陽性和假陰性測出來是一樣的。真實(shí)的檢測方法中間，不會(huì)特異性和敏感度都一定是一樣的。比如有這樣一個(gè)方法，也是同樣人群檢測，我們發(fā)現(xiàn)所有的陰性樣本測出來都是陰性，但是陽性樣本中有5個(gè)測出來陰性。這時(shí)候發(fā)現(xiàn)它的特異性是100%，也就是說沒有假陽性。它的敏感性是86%，準(zhǔn)確度是93%，PPV陽性預(yù)測值是100%。雖然這個(gè)檢測有假陰性存在，但是它沒有假陽性存在，所以測到的陽性一定是陽性，陽性預(yù)測值是100%。有沒有什么樣的方法和它比較接近呢？是有的。比如我們用的PCR方法，如果做好了，它可以把陽性預(yù)測值做的很高。這是日內(nèi)瓦的一個(gè)非盈利組織FIND，對(duì)市面上的部分試劑盒做了一個(gè)客觀評(píng)價(jià)，可以看到不同地方產(chǎn)的試劑盒，檢測不同的基因位點(diǎn)，雖然檢出限有高有低，但總的來說做的都非常好，特異性這個(gè)指標(biāo)都非常高，很多都是100%。有這樣的方法存在，你就知道拿到檢測結(jié)果時(shí)，至少陽性預(yù)測值還是比較接近100%的。

剛才舉的例子都是陽性和陰性樣本各占一半的例子。這個(gè)例子在現(xiàn)階段新冠病毒疾病的情況下有點(diǎn)極端，不太適用。為什么？因?yàn)殛栃灶A(yù)測值跟傳染性疾病的感染率有關(guān)。舉個(gè)例子，500人的群體里做檢測，如果檢測方法的敏感性是95%，特異性是95%，而這個(gè)群體感染率5%，結(jié)果是什么樣呢？真實(shí)的感染者應(yīng)該有25個(gè)，未感染者475人。但是檢測出來的結(jié)果是陰性452個(gè)，其中有1個(gè)假陰性，這個(gè)結(jié)果還好，說明如果你測出來的結(jié)果是陰性的，你是真的陰性的概率是99.8%，這還是相當(dāng)不錯(cuò)的。但是，測陽性的結(jié)果不容樂觀。本來只有25個(gè)陽性樣品，愣是測出來了48個(gè)陽性結(jié)果，其中24個(gè)真的，24個(gè)假的。所以真陽性的概率50%，也就是說，你的結(jié)果是陽性的話，也有一半的可能你體內(nèi)并沒有抗體，你可不能出去瞎逛，還是老老實(shí)實(shí)待在家里比較好。

剛才說的是感染率5%的情況，如果感染率達(dá)到25%，又會(huì)是什么結(jié)果？大概500個(gè)人里面應(yīng)該有125個(gè)感染者，測的結(jié)果里有6個(gè)假陰性、19個(gè)假陽性。如果結(jié)果是陰性結(jié)果，大概98.3%的概率是真陰性，也還不錯(cuò)。如果是陽性結(jié)果，真陽性概率86%，說明你還是有不小的可能，體內(nèi)沒有抗體，你還要出去瞎逛嗎？

剛才舉的例子是基于抗體檢測的試劑表現(xiàn)挺好的一個(gè)假設(shè)，即假設(shè)試劑的檢測敏感性95%、特異性95%，而這并不是那么好做的。

我們想象一下如果這倆指標(biāo)沒有那么高的情況吧。假設(shè)有一個(gè)大城市，感染率為1%，我們坐一個(gè)1000人的抗體檢測。所用的檢測試劑敏感性90%、特異性80%，這個(gè)值符合現(xiàn)在不少試劑的真實(shí)指標(biāo)。那會(huì)有什么樣的結(jié)果呢？1000人里面，因?yàn)楦腥韭适?%，所以真正有抗體的人應(yīng)該有10個(gè)，沒有抗體的人有990個(gè)。這10個(gè)人里面，由于檢測試劑的敏感性是90%，所以有9個(gè)檢測出來是真陽性，1個(gè)是假陰性。在沒有抗體的人里面，因?yàn)闄z測的特異性是80%，所以其中990個(gè)人里面有792個(gè)被測成真陰性，但是198個(gè)人出現(xiàn)了假陽性。所以，檢測結(jié)果出來后是這樣的，測了1000人，結(jié)果207個(gè)呈現(xiàn)陽性，793個(gè)陰性。這說明一個(gè)人如果測到陽性結(jié)果，實(shí)際上只有4%的幾率是真陽性，有96%的可能性并不是陽性。怎么改變這個(gè)狀態(tài)呢？根本的解決方法就是把試劑做的越來越好，比如說再增加一些特異性。假設(shè)特異性增加到90%，這個(gè)結(jié)果就變了，假陽性減少到99個(gè)人。但是這個(gè)結(jié)果，陽性預(yù)測率只從4%提高到8%，陽性結(jié)果中還是有90%以上的假陽性。假設(shè)特異性增加到99%，陽性預(yù)測率可以增長到47%左右。99%的特異性對(duì)抗體檢測來說是很大的難題，因?yàn)檫@已經(jīng)是非常高的指標(biāo)了。這也是為什么檢測能力不夠理想的抗體檢測在感染率低的情況下做大規(guī)模篩查是有很大問題和風(fēng)險(xiǎn)的，我們一定要把統(tǒng)計(jì)學(xué)的基本概念牢牢記在心里。

前幾天美國加州的一幫科學(xué)家聯(lián)合在一起組織了互助合作社，他們橫向比較了不同的抗體檢測方法，共進(jìn)行了12種方法，10種是試紙條，2種是酶吸附。試紙條里面很多是中國廠商的產(chǎn)品，也有美國廠家的產(chǎn)品，結(jié)果看上去都差不多，并沒有哪個(gè)特別一枝獨(dú)秀。所以并不是說大家生產(chǎn)能力差別很大，而是這個(gè)方法的挑戰(zhàn)本身是普遍性的。

上圖可以看到敏感性，在早期的時(shí)候不是特別好，很可能是由于檢測的時(shí)候抗體本身濃度低，所以檢出率低。慢慢敏感性增加，后期大概80%或90%。特異性差別很大，有的相當(dāng)好，有的其中某個(gè)指標(biāo)很不錯(cuò)，有的綜合考慮起來的也還可以。大部分廠家在80%、90%左右，小樣本比較里，有的方法達(dá)到100%。所以抗體測試，尤其是膠體金測試中，總體上看，假陽性率是一個(gè)大問題。

如何做特異性測試呢，是利用新冠核酸陰性的樣品。因?yàn)闆]有辦法從現(xiàn)在大規(guī)模流行進(jìn)行的時(shí)候的樣本中，找到真正的肯定的陰性樣本來做質(zhì)控，只好采用新冠肺炎之前，2018年7月份之前的樣本測試交叉檢驗(yàn)，最后看出來它到底會(huì)不會(huì)有陽性的出現(xiàn)。他們做了很嚴(yán)格的比較，結(jié)果很有意思。

可以發(fā)現(xiàn)這些方法都相當(dāng)不錯(cuò)，他們的方法穩(wěn)定性都相對(duì)不錯(cuò)，只不過現(xiàn)在為止沒有哪個(gè)方法真的具備和核酸檢測一樣穩(wěn)定和優(yōu)秀的特異性，不能完全相信它的結(jié)果，所以假陽性問題一直會(huì)困擾我們。

最后花點(diǎn)時(shí)間講講是否有超越核酸檢測的其它檢測方法，比如測序。測序是過去幾年才被大家提上日程的檢測方法。過去幾個(gè)月，我們正好有一個(gè)方法基本成型了，1月份的時(shí)候我、清華的王建斌和我們中心謝曉亮教授一起發(fā)表了一篇論文，是由狄琳和傅語思兩個(gè)同學(xué)主要完成的。這個(gè)論文中報(bào)道了一個(gè)新的簡便的RNA測序的處理方法，取名SHERRY。把樣品放進(jìn)去之后，用三步法就形成了測序，大大降低了以前這些對(duì)實(shí)驗(yàn)技巧要求非常高的實(shí)驗(yàn)操作的難度，可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定、可靠和快捷獲取。在新冠病毒肆虐的時(shí)候，醫(yī)院都在超負(fù)荷運(yùn)行，醫(yī)院的科研人員也沒有太多時(shí)間去想復(fù)雜的操作流程，所以越簡單的操作流程越有利于為臨床新冠測序服務(wù)。過去幾個(gè)月，我們雖然不能全面復(fù)工，但是我們有幸和北京地壇醫(yī)院的合作者一起，在SHERRY基礎(chǔ)上開發(fā)了新方法，叫MINERVA，這個(gè)方法的出發(fā)點(diǎn)就是真從實(shí)際出發(fā)考慮，如何為臨床服務(wù)。這個(gè)方法不怎么挑樣本，咽拭子、痰、糞便都可以，經(jīng)過提取之后建立第一步的SHERRY文庫，再經(jīng)過富集等步驟就會(huì)有一個(gè)新的文庫做病毒全基因組測序。

通過這個(gè)測序我們研究了80多個(gè)樣本的核酸序列，從中可以看到之前很多沒有辦法用簡單的核酸PCR檢測手段獲取的信息。我們看到了很有趣的現(xiàn)象，比如很多樣本在特定位點(diǎn)中都可能有不同的突變。這是一個(gè)全新的病毒，對(duì)這個(gè)病毒了解得越深刻，越有利于我們防控疫情，也為未來可能的威脅做好準(zhǔn)備。另外，我們并不知道這個(gè)病毒的突變是如何發(fā)生的。突變和疾病發(fā)展有什么關(guān)系？以后會(huì)不會(huì)影響到分子檢測試劑的研究？它的準(zhǔn)確度還能不能保證？突變是不是影響疫苗開發(fā)？是不是影響藥物實(shí)驗(yàn)？這些我們都不知道，所以需要有更多工具來研究。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的北京大学教授黄岩谊：新冠病毒实验室如何进行检测研究?的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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