單細胞測序的知識

? 劉小澤?已關注 2018.07.20 21:33*?字數 1885?閱讀 675評論 0喜歡 7

劉小澤寫于18.7.20
https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.course/index.html

介紹

Bulk RNA-seq:

測量一個大的細胞群體中每一個基因的平均表達水平，對比較轉錄組學（例如比較 不同物種的相同組織） 是有幫助的，但對于研究異質性系統（例如，復雜的組織如腦）還是不夠的，對于基因表達的本質研究不夠深入

scRNA-seq：

2009年由Tang發表，但直到14年才降低測序費用，逐漸進入大家的視野。它測定的是細胞種群中每個基因的表達量分布，對于研究特定細胞轉錄組的變化是重要的。測定的細胞量也由最初的102?漲到了106?并且還在遞增，向著高通量的方向發展。現在有許多處理單細胞測序的流程，比如13年的SAMRT-seq2，12年的CELL-seq，15年的Drop-seq。有一些做單細胞的平臺，包括Fluidigm C1、Wafergen ICELL8、10X Genomics Chromium。

發展歷史

單細胞測序的流程：

測序流程

看著和普通的mRNA轉錄組差不多，取材要求更高了

分析流程

黃色部分對于高通量數據的處理都是差不多的流程；橙色的部分需要整合多個轉錄組分析流程以及顯著性分析，來解決單細胞測序的技術誤差；最后是下游表達量、通路、互作網絡等生物類別的分析，需要使用針對單細胞研發的方法

可以借助許多工具：

• Falco [云端處理流程]

• SCONE(Single-Cell Overview of Normalized Expression)—一個質控和標準化的包

• Seurat-- QC以及后續分析探索數據

• ASAP(Automated Single-cell Analysis Pipeline) —交互式網頁分析

面臨挑戰：

單細胞轉錄組與群體轉錄組的最大不同之一就是：測序文庫是建立在單獨一個細胞上的，并非一群細胞。單細胞目前面臨的挑戰主要是：擴增量目前最多是一百萬個細胞；有可能一個基因在一個細胞中能檢測到中等表達量，但是在另一個細胞中卻檢測不到，這種現象叫做"gene dropouts"。下一步需要增加轉錄本捕獲效率，減少擴增誤差

分析方法：

近幾年，發展起來的方法很多，大體上（并不全面）包括：

• CEL-seq (Hashimshony, 2012)

• CEL-seq2(Hashimshony, 2016)

• Drop-seq(Macosko, 2015)

• InDrop-seq (Klein, 2015)

• MARS-seq(Jaitin, 2014)

• SCRB-seq(Soumillon, 2014)

• Seq-well (Gierahn, 2017)

• Smart-seq (Picelli, 2014)

• Smart-seq2 (Picelli, 2014)

• SMARTer

• STRT-seq (Islam, 2013)

方法主要分為兩大部分：定量與捕獲。

• 定量包括兩種類型：全長以及基于標簽(tag)。前者對每個轉錄本都試圖獲得一致的read覆蓋度，后者只捕獲5‘或者3’端的RNA。定量方法的選擇也影響了后續分析的方法選擇。理論上，全長的方法應該得到轉錄本的平均覆蓋度，但是實際上，覆蓋度經常是有偏差的。基于標簽的方法能夠利用特異性分子標記(Unique Molecular Identifiers, UMIs)提高定量準確度，但是呢，這種限制了轉錄組一端的方法有降低了轉錄本的可拼接性，讓以后的isoform識別變得困難。

• 捕獲的技術決定了細胞如何被篩選、獲取怎樣的測序外的補充信息、數據產量，三種最常用的方法是基于微孔microwell-、微液流microfluidic-、微滴droplet-

  基于微孔的捕獲技術可以使用細胞移液器或激光捕獲分離細胞，并將他們放置于微液流孔中。這樣的一個優勢就是：可以與熒光觸發細胞分離技術(FACS)結合，實現基于表面標記的細胞選擇。對于想要分離特定細胞群的研究很有效；另外一個優勢就是，可以對細胞進行拍照，幫助確定孔中是否存在損傷的或者重復的細胞。當然，他也有缺點，通量低，對每個細胞進行操作需要很大的工作量。

  基于微液流的捕獲技術?例如Fluidigm's C1

  Fluidigm's C1

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相對微孔，它的通量更高。但是他的弱點就是：只有10%的細胞能被捕獲到，加入處理的細胞類型比較稀少，那么能被芯片捕獲的就更少了，數據產出是不夠的。另外芯片相對較貴，但是試劑的價格再降低，日后可能總的價格也會下降。

微滴技術?是將單個細胞包裹在μl級別的液滴中，液滴被搭載到建庫所用的酶上，每個微滴包含一個獨特的條碼(barcode)，由那個被包裝好的細胞產生的所有reads都被貼上了該條碼，也是為了之后對于不同細胞reads的分辨。一般微滴技術的通量最大，查資料得知一秒能包裝7萬個以上的液滴，并且建庫費用合適--0.05美元/細胞。但是高額測序費用又成了他的短板，鑒定出的一般只有一千多個差異轉錄本，覆蓋度還是比較低的

微滴技術

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如何根據實驗選擇測序平臺？

關于捕獲，比如：如果想要分析組織中的成分，那么微滴技術可以提供數量可觀的細胞；如果研究的細胞種群比較稀少，并且有已知的標記，那么最好用FACS，測少量細胞即可；關于定量，比如：如果想要研究不同的轉錄本，由于標簽是有限的，不可能全部標記完這些轉錄本，那么全長的轉錄本定量就更合適；UMIs只能用于使用標簽的方法，在基因水平做定量更有優勢。

2017年Ziegenhain所在的Enard團隊和Svensson所在的Teichmann團隊都比較了不同的方法組合：

• Ziegenhain使用同樣的小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)分析了5種不同的方法，控制細胞數量、測序深度一致，比較了方法的檢測靈敏度、噪聲水平以及各個方法的費用。結果顯示了檢測到基因的數目（給定一個檢測閾值），結果顯示drop-seq檢測到的基因數目比Smart-seq2低了兩倍。因此，方法的選擇對于實驗結果很重要！ Enard團隊

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  Svensson使用的是已知濃度的合成的轉錄本(加入了spike-in)來檢測不同方法的準確度和敏感度 Teichmann團隊

轉載于:https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9818481.html

總結

以上是生活随笔為你收集整理的单细胞测序的知识的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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