2019年，加拿大滑鐵盧大學(xué)劉玨文團(tuán)隊(duì)在Angewa雜志發(fā)表文章“DNA寡核苷酸的冷凍定向拉伸和排列”。研究發(fā)現(xiàn)冷凍可以拉伸DNA，并且核酸鏈與核酸鏈之間的側(cè)向相互作用起重要作用，拉伸DNA寡核苷酸排列。同時冷凍可以使DNA寡核苷酸很容易的吸附在納米材料上，通過穩(wěn)定的熱力學(xué)構(gòu)象，導(dǎo)致更穩(wěn)定共軛配合。

具有識別和催化作用的DNA分子(aptamers, DNAzymes, DNA hybridization probes)一般以典型的單鏈形式存在，但是單鏈DNA的長度僅僅是幾個堿基的長度(小于1nm)，因此控制單鏈DNA的構(gòu)象是非常困難的問題。作者為了監(jiān)測單鏈DNA的構(gòu)象采用冷凍的方法，并首先通過FRET證明。30-mer的隨機(jī)核酸序列兩端分別標(biāo)記Cy3和Cy5，其中Cy3黃色發(fā)射是FRET的供體，Cy5紅色發(fā)射是FRET的受體。在低鹽條件下，溶液呈現(xiàn)黃色熒光，說明發(fā)射主要來自Cy3，DNA是一個舒展的狀態(tài)，FRET發(fā)射概率低。隨著鹽濃度的增加，發(fā)射逐漸轉(zhuǎn)變成紅色，這是由于鹽的加入降低了DNA分子間的電荷排斥作用，壓縮了DNA，提高了FRET的效率(圖1a)。而上述不同鹽濃度的核酸溶液經(jīng)冷凍快速成像，可以發(fā)現(xiàn)所用的樣品呈現(xiàn)紅色熒光。這是由于冷凍使鹽和核酸得到濃縮，增加了FRET效率(圖1c)。向溶液中加入200倍的非標(biāo)記30mer的隨機(jī)核酸序列使得標(biāo)記的DNA直接相互作用最小化，冷凍之前FRET依賴鹽濃度的影響時非常小的，而冷凍之后發(fā)現(xiàn)所有的樣品與鹽濃度無關(guān)都呈現(xiàn)黃色，這是由于冷凍拉伸了DNA(圖1d)。

上述的FRET是通過共價標(biāo)記熒光基團(tuán)進(jìn)行的，為了排除標(biāo)記的干擾，選擇甲基橙染料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中甲基橙和DNA的量子產(chǎn)率順序是quadruplex>dsDNA>ssDNA。以此為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在室溫條件下G15顯示最高的熒光，冷凍之后A15同樣顯示出較強(qiáng)的熒光，這可能是由于冷凍使得polyA按照有序的結(jié)構(gòu)進(jìn)行排列(圖2)。因?yàn)樵谒嵝詶l件下polyA是以平行雙鏈的形式存在，所以推測冷凍的排列結(jié)構(gòu)可以能與其類似。

圖1. 通過FRET證明探針DNA1的構(gòu)象

圖2. 通過TO染色證明探針DNA的構(gòu)象

為了證明polyA的排列方式首先證明形成熒光的polyA的最低組成堿基個數(shù)，由圖2c可知，在AMP的冷凍條件下就有微弱的熒光，隨著堿基個數(shù)的增加，熒光逐漸增加，當(dāng)堿基個數(shù)達(dá)到15時，熒光呈現(xiàn)飽和狀態(tài)。所以排列方式應(yīng)該是鏈間的相互作用，而不是末端的相互堆疊。同時圖2b中polyC和polyT冷凍后也沒有熒光，這可能是由TO不能對其進(jìn)行染色所致，因此在序列的兩端加上帶有A的帽子，結(jié)果如圖2c所示，證明polyT在冷凍狀態(tài)下也是按照某種特定排列方式進(jìn)行排列的。

同時為了測量DNA在冷凍狀態(tài)下的排列數(shù)量，選擇兩種不互補(bǔ)的長12mer的DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一種標(biāo)記熒光基團(tuán)，一種標(biāo)記猝滅基團(tuán)。如果一種類似雙螺旋的復(fù)合體形成熒光會猝滅1/6左右，圖3a結(jié)果顯示當(dāng)DNA以1:1的比例加入到反應(yīng)體系中熒光猝滅在60%左右，因此證明在冷凍狀態(tài)下超過兩條鏈之間相互結(jié)合(圖3c)。

圖3. a)兩種非互補(bǔ)DNA的可能排列；b) 在冷凍狀態(tài)下通過FAM-12-DNA和不同比例的Q-12DNA的熒光比例；c) 顯示DNA在多聚體中排列的機(jī)制；d) 顯示DNA模板形成AuNPs的機(jī)制和在冰上TEM成像e)，在溶液中成像f)；g) DNA-PEI復(fù)合物的機(jī)制和TEM成像，在冰上h),在溶液中i)

為了獲得更直接的TEM成像，首先解決了在冰上成像短DNA序列的難題，文中通過兩種方法，一種是通過ssDNA與HAuCl4在冰上原位形成AuNPs，另一種是通過PEI與DNA形成復(fù)合物，兩種方法都獲得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更加直觀的證明了寡核苷酸鏈在冷凍狀態(tài)下有序排列。

同時DNA功能化的納米材料在生物傳感發(fā)展、直接組裝和藥物遞送過程中是最重要的試劑。當(dāng)DNA與納米材料表面相互作用時，DNA的吸附構(gòu)象可能不是最穩(wěn)定的熱力學(xué)狀態(tài)，因此DNA的構(gòu)象可能極大的影響吸附狀態(tài)，進(jìn)而反過來會影響吸附DNA的強(qiáng)度、穩(wěn)定性和活性。因此將拉伸單鏈DNA使得他們的吸附更一致，共軛配合的能力更高是非常有意義的事情。因此本文選取四種代表性的納米材料，研究冷凍對于他們的吸附產(chǎn)生的影響。由圖4b可知四種納米材料都是陰性納米材料自身基本不能吸附DNA，但是在高鹽條件下可以中和掉DNA骨架上的陰離子使得DNA易于吸附在納米材料上，低鹽冷凍狀態(tài)下同樣可以使DNA吸附在納米材料上(圖4c)。同時圖4d表明經(jīng)冷凍后鏈接上核酸序列之，再溶解納米材料的穩(wěn)定性良好。接下來以DNA/GO為實(shí)例進(jìn)行驗(yàn)證，FAM DNA/GO首先準(zhǔn)備通過300mM的NaCl和無鹽冷凍的兩種方式進(jìn)行交聯(lián)。然后用相同的沒有標(biāo)記的DNA置換FAM DNA。通過冷凍制備的樣品置換速率是更緩慢的(圖4e)，證明冷凍的吸附能力是更強(qiáng)的。這些結(jié)果均表明拉伸的DNA在冷凍定向吸附時保持其構(gòu)象，并且更多的核堿基可與GO表面相互作用。

圖4. a) 冷凍調(diào)控DNA吸附；b)納米材料的ξ電勢；c) 沒有鹽的DNA吸附能力，300mM NaCl的的吸附能力，以及無鹽冷凍狀態(tài)下的吸附能力； d) 納米材料在冷凍后溶解的穩(wěn)定性展示； e) 通過添加相同的DNA但不含FAM標(biāo)記(500nM)從GO(10ug/mL)置換FAM-DNA(50nM)的動力學(xué)

點(diǎn)評：

1.文中提出冷凍調(diào)控DNA寡核苷酸的拉伸和排列的觀點(diǎn)，并且通過FRET，染料法和表面增強(qiáng)拉曼光譜成像等多方面證明，其實(shí)驗(yàn)結(jié)論真實(shí)可信。

2.其中在冷凍狀態(tài)下對短核酸鏈的染色方法值得學(xué)習(xí)借鑒，并且解決了TEM成像困難的難題，使推測的冷凍拉伸、排列的結(jié)論更直觀、準(zhǔn)確的得到驗(yàn)證。

3.納米材料與功能核酸的結(jié)合目前已經(jīng)在生物傳感、藥物的遞送、體內(nèi)成像等方面廣泛應(yīng)用，文中提出冷凍可以提高其結(jié)合能力，并且拉伸構(gòu)象，使其均一排列，這種方法可以解決核酸與納米材料吸附不穩(wěn)定、構(gòu)象變化復(fù)雜等問題。

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Liu, B., Wu, T., Huang, Z., Liu, Y., & Liu, J. (2019). Freezing‐directed Stretching and Alignment of DNA Oligonucleotides. Angewandte Chemie, 131(7), 2131-2135.

總結(jié)

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