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新型微滴反應(yīng)篩選技術(shù)

中科院微生物所微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室杜文斌研究組和黃力研究組共同開發(fā)了一種新型的微流控界面納升注射技術(shù)（Interfacial Nanoinjection, INJ），該技術(shù)可以將傳統(tǒng)的生化反應(yīng)體系微縮在一個(gè)納升體積的油包水微液滴體系中完成。

界面納升注射(INJ)系統(tǒng)

在性能方面，INJ系統(tǒng)通過高精密度的微體積控制實(shí)現(xiàn)不同試劑組分的納升體積分步添加，兼容96和384孔板，可以在預(yù)先填裝礦物油的孔板上，按照程序設(shè)定加入納升樣品或試劑液滴，用于實(shí)現(xiàn)高通量篩選。利用低成本探針可以精確加注的最小體積達(dá)到1 nL，當(dāng)加樣體積為5 nL時(shí)，體積標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11 %。加注的液滴通過離心可以沉降到孔板底部并融合，液滴的融合效率最高，達(dá)到99%以上。利用多次加注樣品、試劑的方法，可以實(shí)現(xiàn)多步反應(yīng)和濃度梯度配置。系統(tǒng)加注的體積精確性、線性和重現(xiàn)性良好。

FACS-INJ單細(xì)胞分析流程和應(yīng)用

流式細(xì)胞熒光激活細(xì)胞分選（FACS）是目前最高效的單細(xì)胞分選技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)病毒、細(xì)菌、真菌和動(dòng)物細(xì)胞的多參數(shù)檢測和分選；利用熒光標(biāo)記，可對(duì)不同類型的細(xì)胞進(jìn)行有效的區(qū)分，分選成功率高。研究團(tuán)隊(duì)將INJ與FACS平臺(tái)相結(jié)合，建立了FACS-INJ單細(xì)胞分選分析流程，應(yīng)用覆蓋了單細(xì)胞表型分析、基因型分析、基因表達(dá)分析以及全基因組擴(kuò)增測序。
　　研究團(tuán)隊(duì)首先利用FACS-INJ系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了病原菌微生物單細(xì)胞耐藥基因的PCR篩查和單細(xì)胞藥敏表型篩查。對(duì)于大幅降低臨床病原檢測的成本，實(shí)現(xiàn)腦脊液、房水等難獲取微量樣品的耐藥基因和表型篩查具有重要意義。
　　其次，FACS-INJ系統(tǒng)還可用于動(dòng)物細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)分析。以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在細(xì)菌胞外多糖處理前后的炎癥反應(yīng)為例，通過熒光激活流單細(xì)胞式分選處理前后的小鼠巨噬細(xì)胞，基于一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，在單細(xì)胞水平解析了次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（HPRT）基因（看家基因）和白介素1β（IL-1β）基因（炎癥反應(yīng)）表達(dá)水平的變化。
　　最后，團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)黃巖誼課題組合作，建立了基于FACS-INJ的微生物全基因組擴(kuò)增測序流程，以獲得未培養(yǎng)微生物的全基因組信息。該方法獲得的微生物基因組污染度較傳統(tǒng)的MDA擴(kuò)增方法顯著降低（<5%），顯著提高了微生物單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)質(zhì)量。平臺(tái)也適用于腫瘤、胚胎等動(dòng)物細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增測序，對(duì)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞測序的覆蓋度達(dá)到60-80%**。

ATAC-seq數(shù)據(jù)分析新篇章

2019年10月8日，清華大學(xué)生命學(xué)院的張強(qiáng)鋒課題組在***《自然通訊》（Nature Communications）上發(fā)表題為SCALE方法基于隱特征提取進(jìn)行單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)分析（SCALE method for single-cell ATAC-seq analysis via latent feature extraction）的學(xué)術(shù)文章。
　　真核生物的染色質(zhì)具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，由DNA一圈一圈纏繞在組蛋白上形成串珠式模型并進(jìn)一步折疊聚集而成。基因的轉(zhuǎn)錄必須要將相應(yīng)的染色質(zhì)打開形成開放區(qū)域才能結(jié)合其他的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此可以說染色質(zhì)開發(fā)區(qū)域是基因組編碼生命的窗口。單細(xì)胞ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）技術(shù)在單細(xì)胞層次上通過Tn5 DNA轉(zhuǎn)座酶在開放染色質(zhì)插入測序接頭進(jìn)行標(biāo)記并測序，從而獲取“高分辨“的單細(xì)胞精度的染色質(zhì)開放圖譜，并依此揭示細(xì)胞異質(zhì)性的調(diào)控機(jī)制。
　　越來越多的研究者們應(yīng)用單細(xì)胞ATAC-seq技術(shù)，在腫瘤、免疫、發(fā)育領(lǐng)域獲取大量的測序數(shù)據(jù)。然而，目前沒有一個(gè)有效的方法可以很好的分析挖掘海量的單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)中寶貴的生物信息。單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)分析的難點(diǎn)在于數(shù)據(jù)本身。第一，細(xì)胞整體的染色質(zhì)開放位點(diǎn)數(shù)有幾十萬之多，造成所謂的“維度災(zāi)難”。另外，由于生物的原因許多潛在的開放沒有信號(hào)，數(shù)據(jù)異常稀疏，技術(shù)限制帶來的數(shù)據(jù)丟失極大程度上加劇了這種現(xiàn)象。特別的，在二倍體基因組上一個(gè)開放區(qū)域一般至多只有兩個(gè)拷貝，使得數(shù)據(jù)近乎二值化。這些問題都給單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)的分析帶來了巨大挑戰(zhàn)。
　　近日，張強(qiáng)鋒課題組發(fā)表的文章提出了SCALE，利用人工智能深度學(xué)習(xí)的方法*，結(jié)合變分自編碼器和高斯混合模型，提取單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)的隱層特征，將問題從復(fù)雜稀疏的高維度的染色質(zhì)開放圖譜空間投射到了簡單抽象的低緯度特征空間。這種處理不但可以發(fā)現(xiàn)和解析細(xì)胞特異性的染色質(zhì)圖譜模式，還通過相似細(xì)胞信息共享，填補(bǔ)了技術(shù)限制導(dǎo)致的缺失值，從而巧妙地解決了單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)中高維度、稀疏性、二值化等問題。SCALE提供了完整的可視化、聚類、數(shù)據(jù)增強(qiáng)、幫助下游生物信息的挖掘，為研究者們解碼單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)提供了有力的工具。

SCALE的模型框架

文章

Yun, J.L.#; Zheng, X.W.#; Xu. P.#; Zheng, X.; Xu, J.Y.; Cao, C.; Fu, Y.S.; Xu, B.X.; Dai, X.; Wang, Y.; Liu, H.T.; Yi, Q.L.; Zhu, Y.X.; Wang, J.; Wang, L.; Dong, Z.Y.; Huang, L.; Huang, Y.Y.; Du, W.B.* Interfacial Nanoinjection-based Nanoliter Single-cell Analysis,?Small,?2019, doi:10.1002/smll.201903739.?　　https://www.nature.com/articles/s41467-019-12630-7

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的“单细胞”前瞻 |新型微滴反应筛选技术ATAC-seq数据分析新篇章的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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