scATAC-seq建库原理，质控方法和新R包Signac的使用
生物信息學(xué)習(xí)的正確姿勢
NGS系列文章包括NGS基礎(chǔ)、在線繪圖、轉(zhuǎn)錄組分析?（Nature重磅綜述|關(guān)于RNA-seq你想知道的全在這）、ChIP-seq分析?（ChIP-seq基本分析流程）、單細(xì)胞測序分析?(重磅綜述：三萬字長文讀懂單細(xì)胞RNA測序分析的最佳實(shí)踐教程)、DNA甲基化分析、重測序分析、GEO數(shù)據(jù)挖掘（典型醫(yī)學(xué)設(shè)計實(shí)驗GEO數(shù)據(jù)分析 (step-by-step)）、批次效應(yīng)處理等內(nèi)容。
ATAC-seq即transposase-accessible chromatin using sequencing，是一種檢測染色體開放區(qū)域的技術(shù)。該方法由斯坦福大學(xué)Greenleaf實(shí)驗室在2013年首次發(fā)表[1]，兩年后該實(shí)驗室又發(fā)表基于單細(xì)胞的ATAC-seq技術(shù)[2]。ATAC-seq相比于之前的FaiRE-seq和DNase-seq，ATAC-seq用Tn5轉(zhuǎn)座酶對染色體開放區(qū)域進(jìn)行剪切，并加上adaptors序列（圖1的紅藍(lán)片段）。最后得到的DNA片段，包括了開放區(qū)域的剪切片段，以及橫跨一個或多個核小體的長片段。
圖1. ATAC-seq[1]
根據(jù)片段長度可以分為Fragments in nucleosome-free regions(<147 base pairs)和Fragments flanking a single nucleosome (147~294 base pairs), 以及更長的多核片段。片段長度分布如下圖，沒有跨越核小體的小片段最多，其次是單核片段，依次遞減。
? 圖2. DNA片段長度分布
scATAC-seq建庫原理
以10x 建庫方法為例[5]，比較scATAC-seq 和scRNA-seq建庫方法的異同。
二者都用膠珠（GEMs）的方法，不一樣的是ATAC膠珠上的序列中不用UMI，因為基因組只有一對序列，無需像RNA一樣定量。另外序列末端用接頭引物Read 1N代替PolyT。
scRNA-seq通過結(jié)合cDNA的PolyA尾進(jìn)行擴(kuò)增，而scATAC-seq的DNA片段沒有PolyA尾，取而代之的是Tn5酶轉(zhuǎn)座剪切時插入的adaptors片段，可以與膠珠上的Read 1N序列互補(bǔ)。
DNA片段接上膠珠后，在另一端加Read2和Sample index序列。在此之前，scRNA-seq需要將cDNA酶切至合適的片段長度，而scATAC-seq的片段不進(jìn)行打碎，接上Sample index和P7序列后進(jìn)行擴(kuò)增。
最后上機(jī)測序。scRNAseq如果是3‘單端測序，Read2讀取最近的100bp讀長，而Read1只讀取16bp的細(xì)胞barcode序列和10bp的UMI序列，共26bp。scATAC-seq則用雙末端測序，讀長一般不低于45bp[3]。
scATAC-seq最后可以得到4個原始文件：
其中I1/2分別是barcode和sample index，R1/2是目的片段的雙末端。
10x提供cellranger軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，如質(zhì)控，比對，peak calling等。
$ cellranger-atac count --id=sample345 \ --reference=/opt/refdata-cellranger-atac-GRCh38-1.2.0 \ --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \ --sample=mysample \ --localcores=8 \ --localmem=64質(zhì)控方法
重要指標(biāo)：
Fraction of fragments overlapping any targeted region
覆蓋注釋區(qū)域的片段比例。目標(biāo)區(qū)域包括TSS，DNase HS，增強(qiáng)子和啟動子等。一般要求大于55%。
Fraction of transposition events in peaks in cell barcodes
轉(zhuǎn)座位點(diǎn)位于peaks區(qū)域的比例。一般大于25%。如果比例過小，有可能是細(xì)胞狀態(tài)不好，或者測序深度不夠。
Enrichment score of transcription start sites(TSS)
轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化分?jǐn)?shù)。閾值選擇根據(jù)基因組而定。人類一般選擇TSS分?jǐn)?shù)大于5或者6的細(xì)胞樣本[3]。如果分?jǐn)?shù)太低說明細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)瓦解，或者實(shí)驗過程細(xì)胞裂解方式不當(dāng)。
TSS標(biāo)準(zhǔn)化分?jǐn)?shù)的計算方法不同，可能導(dǎo)致閾值偏差。10X的標(biāo)準(zhǔn)化方法是cut sites數(shù)除以最小值，而ENCODE的標(biāo)準(zhǔn)是在cut sites數(shù)除以兩個末端各100bp的cut site數(shù)的平均值。由于一般越靠近中間數(shù)值越大，ENCODE的標(biāo)準(zhǔn)化分?jǐn)?shù)整體比10x的分?jǐn)?shù)小一些。
其他指標(biāo)：
Fraction of read pairs with a valid barcode > 75%;
Q30 bases in R1 > 65%;
Q30 bases in R2 > 65%;
Q30 bases in barcode > 65%;
Q30 bases in Sample Index > 90%;
Estimated Number of Cells 500~10000 +- 20%;
Median fragments per cell barcode > 500;
Fragments in nucleosomefree regions >55%;
Fraction of total read pairs mapped confidently to genome (>30 mapq) >80%;
Fraction of total read pairs in mitochondria and in cell barcodes < 40%;
下游分析（以Signac為例）
Signac包由Seurat同一團(tuán)隊開發(fā)，獨(dú)立于Seurat包，在2020年8月開始發(fā)布在GitHub上。目前仍是1.0.0版本[4]。
我們可以用10x官網(wǎng)的PBMC數(shù)據(jù)做演示。
首先加載所需R包：
library(Signac) library(Seurat) library(GenomeInfoDb) library(EnsDb.Hsapiens.v75) library(ggplot2) library(patchwork) set.seed(1234)加載peaks, 細(xì)胞注釋和片段分布數(shù)據(jù)，并創(chuàng)建object。這個object和Seurat object類似，只是在assay里多了peaks等信息。
counts<-Read10X_h5(filename= "atac_v1_pbmc_10k_filtered_peak_bc_matrix.h5") metadata <- read.csv(file = "atac_v1_pbmc_10k_singlecell.csv",header = TRUE,row.names = 1 ) chrom_assay <- CreateChromatinAssay(counts = counts,sep = c(":", "-"),genome = 'hg19',fragments = 'atac_v1_pbmc_10k_fragments.tsv.gz',min.cells = 10,min.features = 200 ) pbmc <- CreateSeuratObject(counts = chrom_assay,assay = "peaks",meta.data = metadata )總共8728個細(xì)胞，87405個features。features不是基因，是基因組的注釋區(qū)域，如啟動子，增強(qiáng)子等。
pbmc[['peaks']] ## ChromatinAssay data with 87405 features for 8728 cells ## Variable features: 0 ## Genome: hg19 ## Annotation present: FALSE ## Motifs present: FALSE ## Fragment files: 1加載注釋:
extract gene annotations from EnsDb annotations <- GetGRangesFromEnsDb(ensdb = EnsDb.Hsapiens.v75) # change to UCSC style since the data was mapped to hg19 seqlevelsStyle(annotations) <- 'UCSC' genome(annotations) <- "hg19" # add the gene information to the object Annotation(pbmc) <- annotationsTSS和blacklist比例計算。
# compute nucleosome signal score per cell pbmc <- NucleosomeSignal(object = pbmc) # compute TSS enrichment score per cell pbmc <- TSSEnrichment(object = pbmc, fast = FALSE) # add blacklist ratio and fraction of reads in peaks pbmc$pct_reads_in_peaks <- pbmc$peak_region_fragments / pbmc$passed_filters * 100 pbmc$blacklist_ratio <- pbmc$blacklist_region_fragments / pbmc$peak_region_fragments pbmc$high.tss <- ifelse(pbmc$TSS.enrichment > 2, 'High', 'Low') TSSPlot(pbmc, group.by = 'high.tss') + NoLegend()質(zhì)控。Signac包用5個指標(biāo)做過濾：
TSS富集分?jǐn)?shù)，大于2；
blacklist比例，小于0.05；
纏繞核小體的片段與非核小體片段（< 147bp）的比例，小于4；
匹配peaks區(qū)域的片段比例，大于15%；
匹配peaks區(qū)域的片段數(shù)，大于3000，小于20000。
降維聚類。
pbmc <- RunTFIDF(pbmc) pbmc <- FindTopFeatures(pbmc, min.cutoff = 'q0') pbmc <- RunSVD(pbmc) pbmc <- RunUMAP(object = pbmc, reduction = 'lsi', dims = 2:30) pbmc <- FindNeighbors(object = pbmc, reduction = 'lsi', dims = 2:30) pbmc <- FindClusters(object = pbmc, verbose = FALSE, algorithm = 3) DimPlot(object = pbmc, label = TRUE) + NoLegend()
創(chuàng)建基因活性矩陣。之前的聚類區(qū)域所用的features是peaks，為了展示不同分群基因活性的差異，首先要創(chuàng)建一個類似RNA表達(dá)的矩陣。用基因加上游2000bp區(qū)域的比對片段數(shù)代表該基因的活性。
展示marker基因活性：
DefaultAssay(pbmc) <- 'RNA'FeaturePlot(object = pbmc,features = c('MS4A1', 'CD3D', 'LEF1', 'NKG7', 'TREM1', 'LYZ'),pt.size = 0.1,max.cutoff = 'q95',ncol = 3 )
與scRNA-seq數(shù)據(jù)的整合分析。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)地址
尋找細(xì)胞分群特異的peaks。
展示基因在不同細(xì)胞類型的開放程度：
此外還有其他分析，如TF footprinting等。footprinting顧名思義是指轉(zhuǎn)錄因子留下的印記，由于Tn5酶不能剪切到TF結(jié)合的區(qū)域，所以footprinting圖相對與TSS圖，中間有“凹陷”，凹陷的程度根據(jù)TF結(jié)合的時間確定[6]。
總的來說，Signac包是一個親民實(shí)用的工具。雖然有一些不足的地方，如染色體的注釋目前只能選擇UCSC的，不能選Ensemble。
參考文獻(xiàn)：
[1]?Buenrostro, J., Giresi,?P., Zaba, L.?et al.?Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.?Nat Methods?10,?1213–1218 (2013). https://doi.org/10.1038/nmeth.2688
[2]?Buenrostro, J., Wu, B., Litzenburger, U.?et al.?Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.?Nature?523,?486–490 (2015).?https://doi.org/10.1038/nature14590
[3]?https://www.encodeproject.org/atac-seq/
[4]?https://satijalab.org/signac/index.html
[5]https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/Cts31zFxXFXVwJ1lzU3Pc/fe66343ffd3039de73ecee6a1a6f5b7b/CG000202_TechnicalNote_InterpretingCellRangerATACWebSummaryFiles_Rev-A.pdf
[6]?Sung, M., Baek, S. & Hager, G. Genome-wide footprinting: ready for prime time?.?Nat Methods?13,?222–228 (2016). https://doi.org/10.1038/nmeth.3766
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總結(jié)
以上是生活随笔為你收集整理的scATAC-seq建库原理，质控方法和新R包Signac的使用的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。
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