生物信息學(xué)習(xí)的正確姿勢(shì)

NGS系列文章包括NGS基礎(chǔ)、高顏值在線繪圖和分析、轉(zhuǎn)錄組分析?（Nature重磅綜述|關(guān)于RNA-seq你想知道的全在這）、ChIP-seq分析?（ChIP-seq基本分析流程）、單細(xì)胞測(cè)序分析?(重磅綜述：三萬字長文讀懂單細(xì)胞RNA測(cè)序分析的最佳實(shí)踐教程)、DNA甲基化分析、重測(cè)序分析、GEO數(shù)據(jù)挖掘（典型醫(yī)學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)GEO數(shù)據(jù)分析 (step-by-step)）、批次效應(yīng)處理等內(nèi)容。

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基于大數(shù)據(jù)整合預(yù)測(cè)土壤枯萎病的發(fā)生

介紹主講人

袁軍，博士，就職于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院沈其榮教授團(tuán)隊(duì)。研究方向：根系分泌物介導(dǎo)的植物-土壤反饋，土壤微生物群落調(diào)控，連作障礙修復(fù)，新型肥料研發(fā)。目前以第一作者在The ISME Journal，Microbiome，SBB，Hortic Res，AEM 等國際著名期刊上發(fā)表十余篇文章 (文章他引700余次)。

研究背景及意義

為什么會(huì)選枯萎病呢？枯萎病是土傳病害里面一個(gè)代表性的病害，其發(fā)病區(qū)域廣泛，宿主種類眾多，孢子存活時(shí)間長，發(fā)病率高，危害大。

為什么要做整合分析

在世界上很多區(qū)域的很多物種都可以發(fā)病，但是很難找到發(fā)病的閾值，而個(gè)例的研究很難從整體的角度來說明問題，并且需要明確回答微生物群落是否存在特征這個(gè)問題，基于這些條件來做整合分析。

研究方法概覽

首先是收集數(shù)據(jù)，一部分?jǐn)?shù)據(jù)用來構(gòu)建模型，另一部分用來模型的預(yù)測(cè)和訓(xùn)練；其后就是對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合和篩選；之后是建立模型，最后把群落特征提取出來并進(jìn)行可視化。

數(shù)據(jù)收集

數(shù)據(jù)的一部分是直接從文獻(xiàn)中獲取數(shù)據(jù)來源，另一部分可以在公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找，因?yàn)楣矓?shù)據(jù)庫中還存在一些文章尚未發(fā)表但是已經(jīng)公開了的數(shù)據(jù)，剩下的一部分來自自己或同行的測(cè)序數(shù)據(jù)。

機(jī)器學(xué)習(xí)方法

機(jī)器學(xué)習(xí)方法有很多，這里羅列了常見的5種。

• 隨機(jī)森林：

  微生物生態(tài)領(lǐng)域應(yīng)用較多，精度高、能處理大量的變數(shù)

• 支持向量機(jī)：

  其他領(lǐng)域常用，比如人臉識(shí)別

• 邏輯回歸：

  最傳統(tǒng)

• 決策樹：

  結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、效率高

• 樸素貝葉斯算法：

  被分類的每個(gè)特征都與任何其他特征的值無關(guān)

樣本數(shù)據(jù)分布

數(shù)據(jù)要有代表性，不一定獲取的每個(gè)項(xiàng)目都有很多樣本，但是項(xiàng)目一定要多。

另外也要注意如果某個(gè)項(xiàng)目的樣本量特別大，這樣做PCA的時(shí)候可能這個(gè)項(xiàng)目的樣本會(huì)單獨(dú)聚為一類，而其他項(xiàng)目聚為另一類。

數(shù)據(jù)整合和過濾

這時(shí)候我們就需要對(duì)樣本進(jìn)行篩選。但篩選并沒有固定的標(biāo)準(zhǔn)，比如去除樣本量大的一部分樣本后，PCA結(jié)果中樣本按照疾病情況等分組聚類，說明這個(gè)篩選方法沒問題。而真菌的項(xiàng)目的樣本量分布比較平均就沒有進(jìn)行過濾，但對(duì)細(xì)菌的的項(xiàng)目的樣本數(shù)量進(jìn)行了過濾。

然后是對(duì)OTU的過濾，因?yàn)槭菍?duì)很多樣本進(jìn)行OTU的聚類，所以會(huì)聚類出很多OTU，比如我們通過對(duì)數(shù)據(jù)聚類出5萬多個(gè)OTU，但是大多數(shù)的OTU豐度很低，對(duì)于研究想獲取的群落特征意義不大，所以我們僅保留了存在于三分之一研究及以上的OTU。

OTU過濾的效果

對(duì)過濾OTU前與過濾OTU后的分析結(jié)果進(jìn)行比較了，可以看到經(jīng)過過濾后，alpha多樣性在疾病組和健康組中存在顯著差異了，而Beta多樣性和物種組成則沒什么明顯的變化，這說明對(duì)樣本過濾是合理的。

特征物種篩選

下面進(jìn)行了機(jī)器學(xué)習(xí)算法的篩選，主要是比較隨機(jī)森林、支持向量機(jī)和邏輯回歸的這三種算法。發(fā)現(xiàn)隨機(jī)森林結(jié)果最好，支持向量機(jī)次之。

機(jī)器學(xué)習(xí)算法中使用的物種分類水平的確定

機(jī)器學(xué)習(xí)算法確定好了后就是選擇基于哪個(gè)物種分類水平來建立模型。通過對(duì)門、綱、目、科、屬、OTU水平的建模結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌只有OTU水平結(jié)果最好，所以細(xì)菌與真菌均選擇了基于OTU來建模。

模型驗(yàn)證

驗(yàn)證這一步是很必要的。那么怎么去驗(yàn)證呢，就是自己去收集不同物種不同地點(diǎn)的數(shù)據(jù)來用于預(yù)測(cè)。

預(yù)測(cè)結(jié)果可以看到除了北京發(fā)病西瓜的真菌數(shù)據(jù)都預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，其他數(shù)據(jù)均基本預(yù)測(cè)正確。這里要單獨(dú)提下百合這個(gè)物種，因?yàn)槲覀冊(cè)加糜跇?gòu)建模型的數(shù)據(jù)并沒有涉及百合，但是使用模型來預(yù)測(cè)百合的結(jié)果基本也是準(zhǔn)確的，這也證明我們預(yù)測(cè)的模型是有代表性的，可以從枯萎病這個(gè)角度來看微生物組成的特征。

特征物種篩選

通過在OTU水平建模，可以得到45個(gè)細(xì)菌特征OTU和40個(gè)真菌特征OTU?？梢钥吹郊?xì)菌的大部分特征OTU在疾病組和健康組豐度還是存在差異的，真菌的熱圖結(jié)果雖然不是很明顯，但是可以從堆積柱狀圖里看到豐度也是存在差異的。

后續(xù)研究還可以深入去挖掘這些微生物對(duì)疾病功能與作用。

特征OTU網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系推斷

細(xì)菌特征OTU網(wǎng)絡(luò)分析表明，健康網(wǎng)絡(luò)中包含的節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)較多，并且網(wǎng)絡(luò)平均度（average degree）和中心緊密度（centralization-closeness）較高。

真菌特征OTU網(wǎng)絡(luò)分析表明，發(fā)病網(wǎng)絡(luò)中包含的節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)較多。

數(shù)據(jù)整合的意義

為什么做數(shù)據(jù)整合呢？首先是想發(fā)現(xiàn)微生物群落的特征，其次也可以為進(jìn)一步驗(yàn)證特征OTU的功能打下基礎(chǔ)，并且綜合多人的結(jié)果得出的結(jié)論更有說服力，也可以進(jìn)一步來佐證自己的觀點(diǎn)。

擴(kuò)增子數(shù)據(jù)整合過程的問題

現(xiàn)在整合很火，因?yàn)楣矓?shù)據(jù)很多，并且沒有經(jīng)費(fèi)也可以開展整合分析。但是我們要重視整合過程中存在的問題，比如最基礎(chǔ)的就是DNA的提取，DNA提取結(jié)果質(zhì)量不好的話就不能保證結(jié)果是否有代表性，發(fā)現(xiàn)的差異是否來自數(shù)據(jù)的真實(shí)差異。另外還有用不同的引物來擴(kuò)增不同的區(qū)域，在整合分析時(shí)也會(huì)有問題。

而在實(shí)際分析也會(huì)遇到很多問題，例如最開始下載的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)超于分析中使用的數(shù)據(jù)，但是一些數(shù)據(jù)可能因?yàn)闆]有提供引物或其他原因無法使用，還有就是比如數(shù)據(jù)是核糖體rDNA的不同的區(qū)域，這時(shí)候可以按照不同區(qū)域?qū)?shù)據(jù)分類，然后獨(dú)立進(jìn)行研究，最后看結(jié)論是否統(tǒng)一。

擴(kuò)增子數(shù)據(jù)整合策略

主要是兩個(gè)策略，一個(gè)是下載原始數(shù)據(jù)通過聚類獲得OTU，從OTU水平進(jìn)行整合，第二個(gè)策略不需要原始數(shù)據(jù)，基于OTU豐度表，在不同分類水平上進(jìn)行整合，這個(gè)方式速度快，精度低 適合大生態(tài)。

擴(kuò)增子數(shù)據(jù)整合進(jìn)一步探索

比如深度評(píng)估不同數(shù)據(jù)差異，這時(shí)候可能考慮引物的影響、數(shù)據(jù)庫的影響，方法的選擇，這里建議大家先做，做了看結(jié)果再說，不要被想法局限。

另外也可以結(jié)合溫度、降雨、土壤的碳、氮等環(huán)境因子進(jìn)行更多層次的分析。

評(píng)估一個(gè)主題是否適合做擴(kuò)增子數(shù)據(jù)整合？

可以從下面幾條來評(píng)估是否適合擴(kuò)增子數(shù)據(jù)整合？

• 是否有重大意義？

• • 關(guān)注這個(gè)問的人多不多？

    如果意義不太大，數(shù)據(jù)量也不是很多，進(jìn)行整合分析就不是特別必要。

• 是否單個(gè)研究無法解決問題？

• • 對(duì)于一個(gè)問題存在爭(zhēng)論，大家都各執(zhí)一詞，就可以整合分析來看結(jié)果會(huì)是什么樣子。

• 是否有大量的相關(guān)研究？

• • 最好是這個(gè)問題已經(jīng)有大量的研究了再進(jìn)行整合，比如整合四篇文章其實(shí)并沒什么意義。

• 可否驗(yàn)證

• • 如果不能驗(yàn)證結(jié)果那結(jié)論只是一面之詞，所以驗(yàn)證在數(shù)據(jù)整合是很重要的一個(gè)方面。

開展一個(gè)數(shù)據(jù)整合項(xiàng)目的時(shí)間

PPT展示了每個(gè)部分花費(fèi)的時(shí)間，但是要注意一個(gè)月并不是一個(gè)月內(nèi)完成這部分內(nèi)容，而是工時(shí)。不過最花費(fèi)時(shí)間的就是數(shù)據(jù)的不斷嘗試、探索和應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)等方法進(jìn)行分析。

致謝

最后感謝團(tuán)隊(duì)帶頭人沈其榮教授和團(tuán)隊(duì)中特別努力的學(xué)生們。

劉永鑫老師總結(jié)亮點(diǎn)

雖然一千多個(gè)樣本整合并不算多，但是能數(shù)據(jù)能包含多個(gè)地點(diǎn)多個(gè)物種，這一點(diǎn)就足夠吸引審稿人。

提問

• Q：一些公共數(shù)據(jù)并沒有上傳barcode序列怎么處理？Y：如果有分組信息的話，這個(gè)數(shù)據(jù)是可以用的。

• Q：有沒有用生態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行挖掘，比如從一些生態(tài)過程和互作模式入手？Y：最近正在做，但是還沒得到比較好的結(jié)果。

• Q：如果一些數(shù)據(jù)沒有分組信息，就不能用這部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析了嗎？Y：是的

• Q：差別大的樣本是直接剔除還是抽平到和其他樣本同樣的水平？Y：隨機(jī)去抽就可以了

• Q：OTU表如何進(jìn)行下載和整合？Y：有的文章會(huì)上傳OTU表數(shù)據(jù)，但我們分析是用原始數(shù)據(jù)來生成OTU表

• Q：多個(gè)研究由批次效應(yīng)，批次效應(yīng)如何消除？質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)？Y：除了批次效應(yīng)、不同的平臺(tái)、引物等都會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響，我們是從發(fā)病與健康的角度來看是否存在差異，并且數(shù)據(jù)很多的時(shí)候，主要差異是來自于發(fā)病與健康。高通量數(shù)據(jù)中批次效應(yīng)的鑒定和處理 - 系列總結(jié)和更新

• Q：依據(jù)您上文提到的關(guān)鍵詞在谷歌學(xué)術(shù)檢索，有4000多個(gè)文獻(xiàn)滿足，如何對(duì)這些檢索結(jié)果過濾？Y：沒什么簡(jiǎn)便的方法，只能通讀一遍看看是否滿足需要

• Q：收集的序列數(shù)據(jù)都是16S的一個(gè)區(qū)？或者有共同的區(qū)域然后切齊？Y：來自于不同的區(qū)域，將不同的區(qū)域片段去和全長的數(shù)據(jù)庫比對(duì)

• Q：發(fā)病土壤來自持續(xù)幾年都發(fā)病的土壤還是偶然發(fā)病的土壤？Y：公共的數(shù)據(jù)有的并沒有提到這個(gè)信息，但我們用于預(yù)測(cè)的樣本來自常年發(fā)病的土壤

• Q：qiime2怎么生成的unifrac距離？R怎么獲得beta多樣性的結(jié)果矩陣？L：我通常習(xí)慣用usearch的beta_div命令來獲得unifrac距離，R可以通過vegan包來計(jì)算各種beta多樣性距離矩陣

• Q：您對(duì)深度評(píng)估不同引物造成的差異有什么建議嗎？Y：剛才也提到過，可以通過分開分析來看結(jié)果是否一致。

• Q：可以分享下載數(shù)據(jù)的腳本嗎？Y：文章中提供的github鏈接中包含分組中用到的腳本

• Q：擴(kuò)增子整合用OTU還是ASV更合適？Y：這篇文章是用的OTU

• Q：機(jī)器學(xué)習(xí)篩選特征OTU是否都得先用大量數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練？以及訓(xùn)練的比例是多少？Y：2/3用于訓(xùn)練，剩下1/3用于驗(yàn)證，不過訓(xùn)練了很多次，每次都是隨機(jī)選2/3用于訓(xùn)練，剩下1/3用于驗(yàn)證

• Q：可以分析下文章解讀鏈接嗎？L：文章解讀鏈接：ISME：南農(nóng)沈其榮團(tuán)隊(duì)基于大數(shù)據(jù)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)土壤的枯萎病發(fā)生

• Q：自己的數(shù)據(jù)是OTU表，但是文章沒有提供OTU表，是不是就無法整合了？Y：只能從不同分類水平上進(jìn)行整合了。

• Q：rdp數(shù)據(jù)庫和Greengene數(shù)據(jù)庫哪個(gè)好？Y：各有所長。rdp包含的數(shù)據(jù)更多一點(diǎn)，Greengene數(shù)據(jù)庫更準(zhǔn)確，但是greengene數(shù)據(jù)很久沒更新了 L：如果是從OTU層面上，很多文章都用的Greengene數(shù)據(jù)庫更容易整合，并且qiime系列用的默認(rèn)數(shù)據(jù)庫就是Greengene數(shù)據(jù)庫

• Q：不同月份采的樣，批次效應(yīng)不去除和去除影響都很大，怎么處理？Y：這個(gè)差異也不一定是完全是批次效應(yīng)帶來的，也有可能來自溫度、水分等環(huán)境因子，可以做環(huán)境因子的分析來看看

• Q：怎么批量爬取文獻(xiàn)？還是一篇篇文獻(xiàn)去下載？Y：可以批量下載，但看文獻(xiàn)還是一篇篇去看

• Q：通過模型來進(jìn)行預(yù)測(cè)的原理是什么？Y：建模后我們獲得45個(gè)特征OTU，但除了OTU的分類信息外，我們還有其相對(duì)豐度信息，相當(dāng)于指紋圖譜，把樣本和這個(gè)信息map一下，就能判斷這個(gè)樣本是發(fā)病樣本還是健康樣本。

• Q：機(jī)器學(xué)習(xí)的意義是什么？Y：通過機(jī)器學(xué)習(xí)就可以獲取特征OTU，這些特征OTU除了有樣本中豐度差異信息，并且也能展示了其對(duì)群落組成的貢獻(xiàn)度。

• Q：45個(gè)特征OTU的P值的標(biāo)準(zhǔn)是什么呢？Y&W：45個(gè)特征OTU是通過機(jī)器學(xué)習(xí)的方法獲取出來的，所以沒有P值結(jié)果，其原理是構(gòu)建好模型后，挑選出45個(gè)對(duì)分類有重要作用的OTU

• Q：看到一些文獻(xiàn)是選擇差異OTU，然后用差異OTU建模，這個(gè)也是可以的嗎？Y：是的，我們其他的文章就是用的這個(gè)方法

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總結(jié)

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