2021年11月8日，美國俄亥俄州立大學（Ohio State University）區健輝（Kin Fai Au）研究組在Nature Biotechnology在線發表綜述論文Nanopore sequencing technology, bioinformatics and?applications，該文章系統全面地回顧總結了納米孔測序技術的發展歷史、技術原理、數據特征、生物信息學分析方法以及廣泛的應用， 同時也指出了目前存在的問題。

自從牛津納米孔技術公司（Oxford Nanopore Technologies, ONT）于2014年推出第一款商業化的納米孔測序儀MinION以來，近幾年納米孔測序技術以及相關的應用都取得了實質的進步。ONT納米孔測序技術的原理主要依賴于具有生物傳感性、內部直徑為納米尺度的蛋白質（nanopore）。在電解質溶液中，通過施加電壓，將帶有負電荷的單鏈DNA或RNA分子驅動穿過納米孔。同時，利用分子馬達蛋白（motor protein）控制DNA或RNA分子的穿孔速度。DNA和RNA堿基序列穿過納米孔傳感區域時所引起的電流變化被實時記錄，并通過生物信息學算法將這些變化的電信號解碼為核苷酸堿基。

米孔測序的概念最早可追溯至20世紀80年代【1】。目前的納米孔測序技術主要包括兩個核心組分：納米孔蛋白和分子馬達蛋白。第一個被用于納米孔測序的納米孔蛋白為alpha-hemolysin, 其內部直徑為1.4至2.4納米；隨后，另外一個具有相似內部直徑（1.2納米）的蛋白MspA也被證實可以用于納米孔測序。分子馬達蛋白（比如phi29 DNA聚合酶）的應用使得DNA或RNA分子穿過納米孔蛋白的速度得到了穩定的控制，進而極大地改善了測序的準確性；同時，分子馬達蛋白可以將雙鏈DNA或者RNA-DNA雜合體解鏈為單鏈分子。

圖1. 納米孔測序原理圖

圖2.?納米孔測序發展

截至目前，ONT公司相繼更新了8個版本的測序系統（從最初的R6到最新的R10.3版本），并推出了適合不同測序通量需求的測序儀?（比如，中等通量的GridION、高通量的PromethION）。ONT測序的準確性從最早的64%增加至如今的95%；目前的測序長度（N50）可以達到50 kb，報道的最長測序長度為2.273 Mb【2】；測序通量也得到了較大的改善，目前，單個PromethION 芯片（flow cell）可以產出大約150 Gb DNA測序數據。特別值得注意的是，ONT可以對RNA分子直接進行測序，因此保留了RNA上的表觀修飾信息（比如, m6A）。

圖3.?納米孔測序建庫流程

圖4.?數據分析流程

進一步，該文章概述了基于ONT測序數據的生物信息學分析模塊：堿基識別（base calling）、DNA（比如，5mC）和RNA（比如，m6A）表觀修飾的直接鑒定、測序讀長（read）的錯誤矯正、序列比對（alignment）、基因組組裝、結構變異檢測、基因組重復序列分析以及轉錄組分析?；趯┠暌寻l表文章的系統統計，作者詳述了ONT測序在11個主要方面的應用：完善已有的參考基因組序列，構建新的參考基因組，鑒定相對較大的基因組結構變異，構建全長轉錄組并分析復雜的轉錄事件，研究基因組表觀遺傳標記，檢測RNA表觀修飾，以及在癌癥、感染疾病、遺傳疾病、病源監測和其他方面的定點（on-site）應用。最后，作者指出了未來ONT測序需要改進的層面：更高的測序準確性（>99%）、更長的測序長度?(Megabase)、降低測序所需的DNA和RNA樣品量。

該文章為了解納米孔測序技術的原理、特點、分析和應用提供了詳實的信息。區健輝課題組的王運浩博士、趙月博士以及研究生Audrey Bollas為共同第一作者。

區健輝課題組(http://augroup.org)長期致力于第三代測序技術（PacBio和ONT）領域的研究，主要涉及第三代測序技術在轉錄組、表觀基因組和表觀轉錄組方面的方法學開發以及生物學應用。目前，該課題組正在招聘博士后，歡迎聯系。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-021-01108-x

引文 ：Yunhao Wang, Yue Zhao, Audrey Bollas, Yuru Wang, Kin Fai Au. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature Biotechnology 2021,39:1348, https://doi.org/10.1038/s41587-021-01108-x

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的师弟新作 | NBT：王运浩、区健辉等综述纳米孔测序技术的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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