细菌基因组 | rpoB的插入变异导致高度耐药性
時(shí)間：2020-6-16
單位：巴西路德大學(xué)
期刊：Tuberculosis (結(jié)核病專業(yè)雜志, IF: 3.13)
鏈接：https://doi.org/10.1016/j.tube.2020.102015
題目：在巴西南部發(fā)現(xiàn)一株對(duì)利福平具有高度耐藥性的結(jié)核分枝桿菌
前 言
? ?結(jié)核病 (Tuberculosis, TB)仍然是世界范圍內(nèi)的重大突發(fā)公共衛(wèi)生事件，目前控制該疾病的努力受到耐藥結(jié)核病 (Drug-resistant TB, DR-TB)病例高比率的威脅。結(jié)核病治療的總體成功率為82%，但多重耐藥 (Multidrug resistance-TB, MDR-TB)，即對(duì)兩種主要抗結(jié)核藥物異煙肼 (INH)和利福平 (Rifampicin, RIF)的耐藥性，與較差的治療結(jié)果有關(guān)，使治愈率降至60%。RIF具有很強(qiáng)的殺菌作用，是抗結(jié)核治療中最重要的藥物之一。
? ?RIF的作用機(jī)制為與rpoB基因編碼的RNA聚合酶 (RNAp)的β亞基結(jié)合，從而抑制細(xì)菌mRNA轉(zhuǎn)錄。結(jié)核分枝桿菌對(duì)RIF耐藥的發(fā)生一般與rpoB基因的單核苷酸替換有關(guān)，主要位于利福平耐藥決定區(qū) (Rifampicin resistance determining region,?RRDR)，是一個(gè)81bp的區(qū)域。
? ?在巴西南部的南里奧格蘭德州研究發(fā)現(xiàn)，在耐多藥結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的435密碼子處插入12個(gè)核苷酸 (nt)，導(dǎo)致了4個(gè)氨基酸 (Q-N-N-P)重復(fù)，這種插入在世界上任何其他地區(qū)都沒有報(bào)道。因此，為了加強(qiáng)巴西南部結(jié)核病控制管理，需要闡明12nt插入的分子和表型后果，以及對(duì)這種菌株傳播到人群的理解。對(duì)于這一建議，基于WGS的研究方法篩選了南里奧格蘭德州的耐RIF結(jié)核分枝桿菌菌株，以確定攜帶12nt插入的菌株。本文研究了這些菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化 (Phylogenetic)關(guān)系，插入突變?cè)诳剐运胶蜕飳W(xué)成本 (Biological cost)上的表型后果，以及對(duì)RIF結(jié)合效應(yīng)的影響的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)。
結(jié) 果
人群與表型耐藥性
? ?在南里奧格蘭德州的174株耐RIF菌株中，有16株 (9.19%)在rpoB基因第435位密碼子上進(jìn)行了12nt插入，均為多重耐藥株。根據(jù)藥敏試驗(yàn) (DST)結(jié)果，在這16株MDR菌株中，一株對(duì)乙胺丁醇 (EMB)額外耐藥，另一株對(duì)鏈霉素 (STR)額外耐藥。其中9人是囚犯，或在監(jiān)獄里呆過一段時(shí)間，2人無家可歸。這些囚犯來自4個(gè)不同的監(jiān)獄機(jī)構(gòu)。(文章結(jié)尾：12nt插入株有可能從監(jiān)獄服刑人群傳播到社區(qū))
RpoB基因12nt插入的分子特征
? ?通過分析rpoB基因的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)12nt插入的發(fā)生情況略有不同?？傮w而言，12nt插入發(fā)生在對(duì)應(yīng)于rpoB基因第435密碼子的基因組位置761111。然而，在16株插入該基因的菌株中，有12株在761110位由腺嘌呤變?yōu)轼B嘌呤，導(dǎo)致第435位氨基酸發(fā)生替換 (GAC>GGC，Asp435Gly)。為了便于理解，將基因組位置761110處具有額外多態(tài)性的12個(gè)核苷酸插入命名為“rpoB INS1” (12/16)，而將僅有12個(gè)nt插入命名為“rpoB INS2”?(4/16)。此外，對(duì)兩株同時(shí)攜帶rpoB INS1和rpoB INS2的菌株 (混合菌株)進(jìn)行了Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與基于NGS的測(cè)序沒有差異。為了了解這種插入在全球其他菌株中可能發(fā)生的情況，基于在線工具TBDreaMDB、MUBII-TB-DB、ReSeqTB中的可用數(shù)據(jù)進(jìn)行了審查，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)這種變異。
顯示12個(gè)核苷酸插入的發(fā)生情況，INS1, INS2
遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化分析
? ?根據(jù)SNP分型 (SNP-based typing)，所有出現(xiàn)12nt插入的菌株均屬于結(jié)核分枝桿菌第4亞型，4.3.3亞型，屬于歐美系 (LAM RD115 sublineage)。同樣，所有菌株都帶有RD115缺失。在計(jì)算機(jī)分型 (In silico spoligotyping)中，有15株菌株具有相同的Spoligo型，屬于Spoligo國(guó)際型 (SIT)，以前被錯(cuò)誤地鑒定為Mycobacterium pinnipedii。其余菌株在重復(fù)序列 (Direct repeat, DR)位點(diǎn)上缺失43個(gè)間隔 (Spacers)，在SITVIT2數(shù)據(jù)庫中被歸類為ATYPIC (SIT 2669)。
? ?此外，包括7個(gè)結(jié)核分枝桿菌譜系、4個(gè)亞系和其他4個(gè)不含12nt插入的SIT863菌株的基因組的系統(tǒng)進(jìn)化推斷表明，12nt插入的菌株與其他SIT863菌株 (下圖淺綠色背景)的親緣關(guān)系很近。基于WGS的系統(tǒng)進(jìn)化分析揭示的另一個(gè)重要事實(shí)是，以5個(gè)SNPs為閾值，這16個(gè)菌株被聚為一個(gè)獨(dú)特的基因組簇。
16株攜帶12nt插入的菌株，4株未插入的SIT863菌株，以及來自主要譜系和4個(gè)亞系的進(jìn)化樹。
基于goeBURST算法的12nt插入和不帶插入應(yīng)變的SIT863的最小生成樹
? ?在耐藥相關(guān)基因突變方面，16株菌株均存在katG基因Ser315Thr突變，其中3株存在與乙胺丁醇 (EMB)耐藥相關(guān)的變異：1株為embA基因 (?11C>A)，1株為embB基因 (Met306Val)，1株為embB基因雙突變 (Gly406Asp和Met306Ile)。此外，1株顯示出與乙硫酰胺抗性相關(guān)的突變(ethA基因755/756密碼子的插入)。
計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)藥物結(jié)合效應(yīng)
? ?本研究模擬了INS1和INS2對(duì)RNAP結(jié)構(gòu)的影響，以預(yù)測(cè)這些多態(tài)性對(duì)RIF和聚合酶之間相互作用的影響。首先先進(jìn)行同源建模，隨著同源模型的驗(yàn)證，使用對(duì)接程序 (Docking programs)來預(yù)測(cè)模型結(jié)構(gòu)中的RIF相互作用。在表1中，可以觀察到，與RNAP_INS1-RIF相互作用和RNAP_INS2-RIF相互作用的平均值相比，對(duì)接到RNAP_wt-RIF結(jié)合位點(diǎn)指示了對(duì)RNAP_wt-RIF相互作用的更大的親和力。
RNAP_wt(淺藍(lán))、RNAP_INS1(紅色)和RNAP_INS2(藏青藍(lán))結(jié)構(gòu)的擬合示意圖
抗性水平與生物代價(jià)
? ?9株攜帶12nt插入的臨床分離株的MIC值為≥32 mg/L，分別測(cè)定了2株12nt插入的臨床分離株 (GI=38.5h)、3株野生型臨床分離株 (GI=20h)和1株敏感對(duì)照株(H37Rv)?(GI=15h)的平均生長(zhǎng)指數(shù)。插入株的生長(zhǎng)速度比野生型和H37Rv株分別慢1.95和2.5倍，表現(xiàn)出適應(yīng)性劣勢(shì)。
結(jié) 果
? ?本研究描述了近年來在巴西南部出現(xiàn)的一種結(jié)核分枝桿菌菌株的關(guān)鍵分子和表型特征，該菌株在rpoB基因上有一個(gè)罕見的12nt插入突變，導(dǎo)致了高水平的RIF耐藥。系統(tǒng)發(fā)生學(xué)方法 (系統(tǒng)進(jìn)化分析)表明，12nt插入株有可能從監(jiān)獄服刑人員傳播到社區(qū)，這表明有必要加強(qiáng)對(duì)服刑人員中結(jié)核病傳播的監(jiān)測(cè)，以及該地區(qū)抗結(jié)核治療的工作，特別是MDR株。由于對(duì)RIF的高度抗藥性及其已確定的持續(xù)性傳播，監(jiān)測(cè)這種毒株在人群中的傳播至關(guān)重要。有必要對(duì)這種描述的菌株進(jìn)行更快速、更實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，以切斷其傳播。對(duì)于這一建議，有必要進(jìn)行基于PCR的快速檢測(cè)，快速、簡(jiǎn)便和低成本地鑒定該菌株。
聊生信復(fù)現(xiàn)
從頭分析獲得的VCF文件中記錄的變異 (服從NGS左移原則，變異位置：761110)
灰色：利福平；淺藍(lán)：野生；紅色：INS1；紫色：INS2
(聊生信)
—? ?基本概念?—
外顯子和基因組基本概念(一)
外顯子和基因組基本概念(二)
??蛋白質(zhì)生物學(xué)推介（一）
??蛋白質(zhì)生物學(xué)推介（二）
??蛋白質(zhì)生物學(xué)推介（三）
??蛋白質(zhì)生物學(xué)推介（四）
??蛋白質(zhì)生物學(xué)推介（五）
—? ?文獻(xiàn)解讀? —
一個(gè)家系突變分析一篇 SCI | 文章解析
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總結(jié)
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