肝母細胞瘤（HB）是最常見的兒童惡性肝臟腫瘤之一，80%~90%發生在5歲以內。HB被認為來源于肝前體細胞，在形態上與未成熟的肝細胞相似。目前，通過術前化療和手術切除，已成功挽救了許多患者的生命。對于該癌癥的早期患者，治療后的五年生存率已超過80%。但對于晚期患者，五年生存率低于60%。此外，醫學上對HB的臨床預測指標并不完善，因此改善高度惡性HB患者的預后，對HB進行惡性分級評估非常必要。?

近期，來自廣島大學生物醫學與健康科學研究所小兒外科的檜山英磯博士在Nature?Communications雜志上在線發表題為“Genetic and epigenetic basis of hepatoblastoma diversity”的文章。研究團隊根據從日本小兒肝臟腫瘤研究組（JPLT-2）獲得的數據對163例兒童肝臟腫瘤（154例HBs和9例肝細胞癌）進行了綜合基因組分析。研究結果闡明了肝母細胞癌變過程中的分子機制，并通過全面的基因組、表觀基因組和轉錄組分析確定了HB在分子水平上區分的亞型。

文章發表在Nature?Communications上

研究人員首先使用全基因組測序分析（WGS）、全外顯子組測序分析、PCR和sanger測序檢測外顯子中特殊的片段——CTNNB1。通過大量組學手段的分析，結合Karkinos軟件的分析，繪制出HB的種系突變譜圖（圖1）。研究發現，在所有腫瘤數據中CTNNB1基因大量缺失，說明CTNNB1是最常突變的基因（77.6%）。此外，根據測序數據發現，HB的突變頻率與診斷年齡呈正相關（圖 1c）；HB的突變頻率顯著低于成人肝細胞癌（HCC）（圖 1b）。基于WGS數據的體細胞堿基替換模式分析（圖? 1d）顯示，最常見的堿基替換是C-to-T轉換（32%），其次是C-to-A轉換（21%）和T-to-C的轉換（20%）。

圖1.HB的突變譜圖。來源：Nature?Communications

隨后，研究人員通過Affymetrix 6.0 SNP陣列分析、GISTIC2.0分析和WGS分析，確定了HB的SV、SNP和染色體穩定性（圖2）。Affymetrix 6.0 SNP陣列分析了112個HB體細胞拷貝數變化，以識別染色體臂水平的增加和丟失、區域性擴增和缺失以及單親二體（UPD）（圖 2a）。陣列分析發現，4q35.1的缺失包含了IRF2基因（圖 2b）。IRF2基因被報道為HCC中p53相關的腫瘤抑制基因。SNP陣列上的等位基因特異性調用顯示，11p染色體中有39例（34.2%）UPD，其中包含H19/IGF2印記區域（圖 2c）。染色體的穩定性分析顯示32例（29%）具有染色體不穩定性（CIN）（圖 2d）。?

圖2.HB基因組的SV和基因組穩定性。來源：Nature?Communications

隨后，研究團隊通過RNA測序和共識聚類分析確定了三種腫瘤亞型和正常組織（圖3）。

“proliferative”：主要表達細胞周期相關基因（CCNB2、E2F1、MKI67、MYCN）和AFP，表明其具有細胞增殖的侵襲性。該亞型的腫瘤還具有經典Wnt 靶向基因（LGR5、TBX3、BMP4、ASCL2、RNF43、DKK1、SP5、NOTUM和GPC3）的高表達，這些基因與CTNNB1的高頻率突變或缺失相關。

“mesenchymal”：腫瘤中上調的基因組以T細胞受體、基質金屬蛋白酶（MMPs?）和顆粒酶（GZMs）為特征，表明細胞毒性免疫細胞（CTLs、NKT 和單核細胞) 的腫瘤內浸潤與ECM降解相關。

“hepatocyte”：腫瘤高表達與成熟肝細胞代謝功能相關的基因，；例如細胞色素P450（CYPs）、UDP葡萄糖醛酸轉移酶（UGTs）和金屬硫蛋白家族基因（MTs）。?

圖3.HB中的基因表達亞型。來源：Nature?Communications?

研究團隊還對146個腫瘤和11個非癌性肝組織使用Infinium HumanMethylation450 BeadChip （Illumina）分析。BeadChip和全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）顯示出臨床樣本中甲基化水平的良好相關性。從兩種已知 ICR的甲基化分析結果中可以得出，在肝母細胞癌發生過程中父本等位基因會被優先選擇。IGF2啟動子1（Pr1），被稱為成人肝臟特異性啟動子，在胎兒肝臟（胎齡18周）中甲基化密集，但在兒童HB肝臟中以年齡依賴性方式逐漸低甲基化（圖 4）。相反，Pr2（胎兒組織啟動子）在非癌性肝臟樣本中表現出甲基化逐漸增加，在成人肝組織中表現出甲基化密集。

圖4.HB中IGF2啟動子的甲基化狀態。來源：Nature?Communications?

研究團隊通過CHIP-seq技術，使用H3K27ac探針，基于甲基化水平將HB進行分型（圖5）。亞型E1腫瘤具有TLCT/HCN-NOS和TERT啟動子突變，E1中的超甲基化顯示富含GC的序列富集，這意味著富含CpG的增強子附近的超甲基化。E2/3亞型在H19/IGF2區域中表現出高頻率的拷貝數畸變，表明該亞型具有高有絲分裂活性的胚胎表型。亞型E4顯示出增強子甲基化的細微變化，可能是由于腫瘤含量低（“正常樣”）。E4中的低甲基化顯示出ETS因子識別基序的富集，與免疫細胞的腫瘤內浸潤一致。

圖5.HB中的增強子甲基化亞型和異常低甲基化。來源：Nature?Communications?

上述研究結果表明，HB表觀遺傳失調以及IGF2啟動子的異常甲基化模式，可能支持HB細胞中“細胞起源”的假設（圖6）。?

圖6.兒童和成人肝臟惡性腫瘤的“起源細胞”假說概述。來源：Nature?Communications?

在細胞從定形內胚層向成肝細胞和肝細胞分化成熟的過程中，干細胞相關因子ASCL2和永生相關基因TERT的表達降低，自我更新能力下降。由于遺傳和表觀遺傳異常，源自成熟肝細胞的經典HB表現出Wnt的高激活和IGF2的持續上調，而源自具有低TERT表達的成熟肝細胞的成人肝細胞癌（HCC）由于啟動子突變表現出上調和病毒式整合。Wnt 激活（25%）主要是由于CTNNB1的突變。?

總結

雖然兒童肝腫瘤國際合作（CHIC）近期的評估表明HB臨床和表型多樣性，但尚未對其分子背景進行分析。此前研究中包括的患者數量不足以確定個體間異質性或僅應用于單個分子特征。在該研究中，原發性兒童肝臟惡性腫瘤的綜合分子分析揭示了HB中基因組、表觀基因組和轉錄組特征的明顯多樣性。全基因組和全外顯子組分析表明，HB的基因組畸變與診斷時的年齡密切相關。拷貝數分析結果顯示，28.6% HB的染色體不穩定。此外，研究團隊基于這個龐大的HB樣本群確定了分子水平區分的HB亞型。HB系統的分子分析對于了解在肝母細胞癌發生過程中發生的表觀遺傳驅動事件至關重要，可為精準醫學中的風險分層提供必要線索。?

參考文獻：

Nagae, G., Yamamoto, S., Fujita, M., Fujita, T., Nonaka, A., Umeda, T., ... & Hiyama, E. (2021). Genetic and epigenetic basis of hepatoblastoma diversity.?Nature Communications,?12(1), 1-16.

https://www.nature.com/articles/s41467-021-25430-9#Sec31

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的Nature子刊 | 通过多组学手段系统解析儿童肝母细胞瘤分子特征，为临床诊断提供精确参考...的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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