軟件安裝

官方提供了編譯好的jar包，方便使用

wget https://github.com/broadinstitute/pilon/releases/download/v1.23/pilon-1.23.jar

java -Xmx16G -jar pilon-1.23.jar

如果要順利運(yùn)行程序，要求JAVA > 1.7, 以及根據(jù)基因組大小而定的內(nèi)存，一般而言是1M大小的基因?qū)?yīng)1GB的內(nèi)存。

總覽

Pilon有如下作用

對(duì)初步組裝進(jìn)行polish

尋找同一物種不同株系間的變異，包括結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)

他以FASTA和BAM文件作為輸入，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)輸入的參考基因組進(jìn)行提高，包括

單堿基差異

小的插入缺失(indels)

較大的插入缺失或者block替換時(shí)間

填充參考序列中的N

找到局部的錯(cuò)誤組裝

最后它輸出polish后的FASTA文件, 以及包含變異信息的VCF文件(可選)

分析流程

推薦使用PCR-free建庫(kù)測(cè)序得到的Illumina paired-end數(shù)據(jù)，這樣子避免了PCR-duplication,有效數(shù)據(jù)更多，也不需要在分析過(guò)程中標(biāo)記重復(fù)。

下面步驟，假設(shè)你的組裝文件為draft.fa, 質(zhì)量控制后的illumina雙端測(cè)序數(shù)據(jù)分別為read_1.fq.gz和read_2.fq.gz

第一步：比對(duì)

bwa index -p index/draft draft.fa

bwa mem -t 20 index/draft read_1.fq.gz read_2.fq.gz | samtools sort -@ 10 -O bam -o align.bam

samtools index -@ 10 align.bam

第二步：標(biāo)記重復(fù)(非PCR-free建庫(kù))

sambamba markdup -t 10 align.bam align_markdup.bam

第三步：過(guò)濾高質(zhì)量比對(duì)的read

samtools view -@ 10 -q 30 align_markdup.bam > align_filter.bam

samtools index -@ 10 align_filter.bam

第三步：使用Pilon進(jìn)行polish

MEMORY= #根據(jù)基因組大小而定

java -Xmx${MEMORY}G -jar pilon-1.23.jar --genome draft.fa --frags align_filer.bam \

--fix snps,indels \

--output pilon_polished --vcf &> pilon.log

一般Pilon迭代個(gè)2到3次就夠了，所謂事不過(guò)三，過(guò)猶不及。

關(guān)于Pilon的一些參數(shù)說(shuō)明：

--frags表示輸入的是1kb以內(nèi)的paired-end文庫(kù)，--jumps表示 大于1k以上的mate pair文庫(kù), --bam則是讓軟件自己猜測(cè)

-vcf: 輸出一個(gè)vcf文件，包含每個(gè)堿基的信息

--fix: Pilon將會(huì)處理的內(nèi)容，基本上選snps和indels就夠了

--variant: 啟發(fā)式的變異檢測(cè)，等價(jià)于--vcf --fix all,breaks, 如果是polish不要使用該選項(xiàng)

minmq: 用于Pilon堆疊的read最低比對(duì)質(zhì)量，默認(rèn)是0。

閱讀日志輸出

這個(gè)日志文件是標(biāo)準(zhǔn)輸出而不是標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤輸出，不過(guò)保險(xiǎn)起見(jiàn)用&>

最開(kāi)始，Pilon會(huì)輸出他的版本信息(如下示例)，以及將會(huì)對(duì)基因組做的調(diào)整,

Pilon version 1.14 Sat Oct 31 14:30:00 2015 -0400

Genome: genome.fasta

Fixing snps, indels

其中Fixing后面的含義為：

"snps": 單堿基差異

"indels":小的indel的差異

"amb": 替換原有的N

"gaps": 填充基因組的gap

"local"： 檢測(cè)和修改錯(cuò)誤組裝

"all": 上述所有

"none": 不是上述的任何一種

接著Pilon會(huì)分染色體對(duì)BAM文件進(jìn)行處理，根據(jù)BAM文件進(jìn)行堆疊(pileup), 這個(gè)時(shí)候它會(huì)輸出有效reads的深度，這里的有效reads包括未成對(duì)的read和正確成對(duì)的read。

Processing ctg1:1-5414473

frags align_mkdup.bam: coverage 19

Total Reads: 808985, Coverage: 19, minDepth: 5

從Pilon v1.14開(kāi)始，Pilon還會(huì)輸出基因組得到確認(rèn)的堿基比例。

Confirmed 5403864 of 5414473 bases (99.80%)

后續(xù)是Pilon將會(huì)對(duì)原參考基因組做的一些調(diào)整的總體情況，如下表示糾正2個(gè)snp, 2個(gè)小的插入，4個(gè)缺失。

Corrected 2 snps; 0 ambiguous bases; corrected 2 small insertions totaling 12 bases, 4 small deletions totaling 6 bases

最后聲明當(dāng)前部分處理結(jié)束

Finished processing ctg1:1-5414473

如果，在--fix中選了gaps, 那么輸出的內(nèi)容還有如下內(nèi)容。其中82048 -0 +276解釋為在坐標(biāo)82428處移除0個(gè)堿基，插入276個(gè)堿基。

# Attempting to fill gaps

fix gap: scaffold00001:82428-93547 82428 -0 +276 ClosedGap

參考資料

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的nextpolish安装_「三代组装」使用Pilon对基因组进行polish的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

如果覺(jué)得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。