调焦后焦实现不同距离成像_“物镜校正环调节”对显微成像的影响
蓋玻片是顯微鏡制樣中常用的耗材，但是蓋玻片是有厚度的，它會對光線穿行造成一定的改變，從而影響成像的清晰度和亮度。由于絕大部分的物鏡是針對0.17mm(或者稱為#1.5)蓋玻片進行設計生產的，因此常規制樣過程中，顯微鏡廠商一般推薦使用厚度為0.17mm的蓋玻片以達到最佳的成像效果。
但是市面上的蓋玻片耗材多種多樣，厚薄不一(見表1)。除此之外，在倒置顯微鏡上，經常會使用諸如培養皿、多孔板等各種不同類型的耗材，有些器皿的底部厚度甚至達到了1-2mm。此時，必須使用帶有校正環功能的物鏡來進行成像。
表1、MatTek公司不同號碼蓋玻片及其對應的實際厚度
在倒置顯微鏡中，經常需要配置長工作距離物鏡，因為長工作距離物鏡不僅能用于載玻片觀察，還能兼容不同底部厚度的器皿，進行活細胞觀察。在長工作距離物鏡上，我們經常會發現有一圈能左右轉動的校正環(圖1)。針對不同厚度的耗材，我們需要將校正環調節到不同位置。
圖1、帶校正環的20倍和63倍物鏡。英文簡寫CORR代表此物鏡帶有校環，校正環可以左右轉動，將環上的小點位置調節至當前使用蓋玻片或器皿底部的厚度處。
別小看了這個校正環，它對顯微成像會產生很大的影響。我們使用0.17mm蓋玻片的樣品進行了相應測試。明場成像時，如果校正環調節位置不對，成像清晰度會嚴重下降，而且是無法通過鏡體調焦旋鈕來改善的(圖2)。在對熒光成像時，校正環設置不準確，除了清晰度下降以外，熒光的亮度也會發生大幅下降(圖3)。因此，大家在倒置顯微鏡上觀察時，記得要確認一下物鏡是否帶有校正環，校正環的位置調節是否正確。
圖2、腎臟病理切片的明場成像。成像物鏡為帶校正環的40倍物鏡，校正環位置分別為0(左上)，0.17(右上)，1.0(左下)，2.0mm(右下)。
圖3、Mito-TrackerRed標記的線粒體熒光成像。成像物鏡為帶校正環的63倍物鏡，校正環位置分別為0.3(上)，0. 7(中)，0.17 mm(下)。
但是，倒置顯微鏡在物鏡轉盤處的操作空間狹小，對于手指粗壯的男同胞來說，伸手進去調節校正環稍顯麻煩。特別是在搭載了雙熒光光路和孵育箱的活細胞工作站上(圖4)，手動調節校正環會變得更加吃力。
圖4、搭載雙熒光光路的DMi8活細胞工作站(上圖配置的為培養小室，下圖配置的為大型孵育箱)
一直以來，徠卡將人性化設計貫穿于所有產品之中。針對倒置顯微鏡物鏡轉盤處操作空間狹小，手動調節校正環困難的問題，徠卡推出了獨家設計的motCORR物鏡，可通過外部旋鈕和LAS X成像軟件，即可對物鏡校正環進行全電動調節(圖5)。
圖5、徠卡motCORR物鏡(左)，可通過外部旋鈕(右下)和LAS X成像軟件(右上)進行物鏡校正環全電動調節。
尤其是在一些高端成像方式中，經常需要對物鏡的校正環進行調節(圖6)。motCORR能提供比手動調節更可靠的參數設置，而且更具有可重復性。
圖6、徠卡motCORR物鏡非常適用的三大應用方向：FCS(左)、多光子(中)和活細胞(右)成像。
如在FCS(Fluorescence Correlation Spectroscopy，熒光相關光譜)成像時，通過motCORR可輕松將共聚焦激發體積調節接近至數學模型，從而得出更加準確的FCS分析結果。其次，在做活體厚組織紅外多光子成像時，由于組織內部的折射率不均一，會導致結構扭曲，熒光亮度大幅下降，通過motCORR對樣品折射率的校正，以獲得亮度和對比度更高的組織深部熒光圖像，達到更大的穿透深度。此外，motCORR可與高數值孔徑的水鏡、水鏡自動加水微泵和AFC(adaptivefocus control)自適應穩焦系統全面兼容，輕松實現完美活細胞成像。
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