原創(chuàng) xiaoyudian 圖靈基因 今天

收錄于話題 前沿分子生物學(xué)技術(shù)撰文：xiaoyudianIF=10.419推薦度：?????亮點(diǎn)
1、文章系統(tǒng)地介紹了4Pi-SMS系統(tǒng)的路徑、性能及配置等情況，并通過改進(jìn)進(jìn)一步增強(qiáng)其震動(dòng)穩(wěn)定性和重復(fù)性，并縮短時(shí)間周期。
2、文章利用建立的4Pi-SMS系統(tǒng)，通過實(shí)際的應(yīng)用闡述了從樣品制備到獲得全細(xì)胞圖像和分析原始圖像數(shù)據(jù)，建立超分辨率3D數(shù)據(jù)集的過程，并在此基礎(chǔ)上，分析4Pi-SMS的優(yōu)勢與不足。

近日，來自英國、美國、中國和德國的研究人員Jingyu Wang等人合作在《Nature Protocols》上發(fā)表了一篇名為“Implementation of a 4Pi-SMS super-resolution microscope”的文章。文中詳細(xì)介紹了4Pi-SMS儀器的光學(xué)機(jī)械組件的裝配、光路校準(zhǔn)和性能測試。該協(xié)議還提供了如何制備測試樣品、操作該儀器以獲取全細(xì)胞圖像和分析原始圖像數(shù)據(jù)以重建超分辨率3D數(shù)據(jù)集的說明。此外，還提供了故障排除指南，并給出了預(yù)期結(jié)果的示例。除此之外，生產(chǎn)周期也盡可能的降低，未來具有良好的推廣和發(fā)展前景。

當(dāng)前對于細(xì)胞及分子水平的研究，越來越受到顯微鏡分辨率的限制，傳統(tǒng)的白光和激光共聚焦的光斑尺寸無法達(dá)到這樣的分辨率，4Pi -SMS顯微技術(shù)是一種超分辨率熒光成像技術(shù)，與SMLM相比，4Pi檢測在XY方向的定位精度提高了一倍，Z軸方向的分辨率提高了近6倍。本研究中對于如何組裝、測試和操作4Pi-SMS顯微鏡進(jìn)行詳細(xì)的說明。
研究中首先結(jié)合SMLM進(jìn)行4Pi檢測，采用干涉PALM (iPALM) 3個(gè)干涉通道，然后采用4個(gè)4Pi-SMS干涉通道。在這種方法中，通過將模型函數(shù)擬合到單分子圖像上，利用傳統(tǒng)的SMLM技術(shù)確定分子的橫向XY位置。利用4Pi干涉效應(yīng)，高精度地找到每個(gè)分子的軸向Z位置。為了達(dá)到所需的干涉對比度，兩個(gè)光路之間的光程長度差必須在單個(gè)發(fā)射器的相干長度內(nèi)，通常為5-10 μm。同時(shí)，在每個(gè)目標(biāo)后，在每個(gè)光路中故意添加散光。由散光引起的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)畸變允許分子的z-位置被分配到4Pi干涉圖的一個(gè)峰上，從而消除了軸向定位的模糊性。通過引入像散的概念，采用自適應(yīng)光學(xué)方法對PSF進(jìn)行成形，并對隨深度變化的樣品像差進(jìn)行校正。

圖1顯示了4Pi-SMS檢測系統(tǒng)的光路圖。熒光發(fā)射由兩個(gè)相對的物鏡(OBJ0和OBJ1)收集，然后定向到兩個(gè)對稱的，相同的上和下光束路徑，各自的光束路徑通過寬頻消色差QWPs (QWP0和QWP1)，引入激發(fā)激光的二色鏡(DI0和DI1)，兩對透鏡將物鏡后瞳平面成像到DMs (DM0和DM1)上，并最終形成非偏振50/50分光鏡多維數(shù)據(jù)集(NPBS)。

相對于發(fā)射路徑，系統(tǒng)的激發(fā)裝置安裝在垂直面板的另一側(cè)，如圖2所示。圖1b中給出了激發(fā)路徑的光學(xué)布局。激發(fā)光通過單模保偏光纖傳輸?shù)较到y(tǒng)。從光纖發(fā)射的光經(jīng)過準(zhǔn)直，并沿著一條直線通過一個(gè)矩形光圈，然后一個(gè)透鏡將激發(fā)光聚焦到OBJ1的后光圈。矩形孔徑用于限制樣品處的照明面積，從而避免了未成像區(qū)域的不必要的光漂白，并減少了來自自發(fā)熒光和散射的背景。光束尺寸、光圈尺寸和聚焦透鏡的選擇使樣品得到更均勻的照明。激發(fā)路徑還包括兩個(gè)倒裝鏡，可以引導(dǎo)激發(fā)光束通過另一個(gè)路徑，從而在樣品處形成一個(gè)大的照明區(qū)域，用于樣品定位和識別。
此外，激發(fā)路徑包括用于實(shí)時(shí)目標(biāo)對準(zhǔn)的近紅外激光束(LS1，圖1b)。近紅外光束從一根光纖發(fā)射出來，相對于激發(fā)光沿相反的方向傳播，然后被二向色鏡分離，定向到攝像機(jī)(CAM1)上。柱面鏡頭(CY0)在近紅外光束路徑增加散光之前聚焦到相機(jī)。目標(biāo)的相對橫向位置可以通過觀察攝像機(jī)上的聚焦點(diǎn)來跟蹤。柱面透鏡所引入的散光能夠跟蹤目標(biāo)的軸向位置。從這個(gè)相機(jī)的圖像是用來糾正目標(biāo)位置通過閉環(huán)控制。
研究者利用市場上可獲得的光學(xué)機(jī)械部件構(gòu)建該系統(tǒng)，同時(shí)從振動(dòng)穩(wěn)定性，重復(fù)性和便捷性三個(gè)方面對其進(jìn)行反復(fù)的實(shí)驗(yàn)和改進(jìn)。在應(yīng)用的過程中，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)具有顯著的3D各向分辨率，能夠在細(xì)胞生物學(xué)中國提供接近于電子顯微鏡的免疫熒光標(biāo)記特異性的三維分辨率；此外，可以很容易地添加多色成像，并且與使用探針切換的任何基于定位的方法進(jìn)行兼容；該系統(tǒng)還允許使用自適應(yīng)光學(xué)對整個(gè)細(xì)胞的厚度進(jìn)行成像；穩(wěn)定性較好，且后期校準(zhǔn)維護(hù)相對簡單。同時(shí)，也存在著局限性，系統(tǒng)的低時(shí)間分辨率排除了活細(xì)胞成像的可能性，限制了樣品的物理空間?？偟膩碚f，這個(gè)系統(tǒng)是一個(gè)優(yōu)秀的選擇，對于應(yīng)用程序，能夠提供需要的卓越的3D分辨率。教授介紹

Joerg Bewersdorf，美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授，細(xì)胞生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程教授。長期以來一直在超分辨率光領(lǐng)域做出貢獻(xiàn)顯微鏡的發(fā)展以及這些技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)問題中的應(yīng)用。
當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了超高分辨率的STED顯微鏡，單分子定位顯微鏡（FPALM / PALM / STORM / PAINT等）和泛擴(kuò)展顯微鏡（pan-ExM）技術(shù)。該團(tuán)隊(duì)正在積極開發(fā)以提高這些成像技術(shù)的功能（速率、3D分辨率、穩(wěn)定性、多色標(biāo)記），擴(kuò)大超分辨率顯微鏡的應(yīng)用范圍，并嘗試將它們應(yīng)用于一系列生物學(xué)問題。目前已在Nature子刊等雜志發(fā)表了多篇高影響力的論文。參考文獻(xiàn)
Wang, J., Allgeyer, E.S., Sirinakis, G. et al. Implementation of a 4Pi-SMSsuper-resolution microscope. Nat Protoc (2020).https://doi.org/10.1038/s41596-020-00428-7.

總結(jié)

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