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參考：產(chǎn)品手冊

PacBio三代全長轉錄組有什么優(yōu)勢？

近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展，轉錄組測序已經(jīng)成為研究基因表達調控的主要手段。但二代的轉錄本重構準確率很低，三代可以直接得到全長轉錄本，無需組裝。可改善基因表達定量結果，發(fā)現(xiàn)新的基因和轉錄異構體，鑒定可變剪切及基因融合現(xiàn)象。

Google第一個就是官網(wǎng)介紹，可以立馬理解Iso-Seq的字面意思了。

Iso-Seq 就是 isoform sequencing，中文就是同源異構體測序，其實也是一種 RNA 測序技術。

The challenge of isoform reconstruction（即二代的不足）：

真核組織中，大多數(shù)gene是可變剪切的，產(chǎn)生多種transcript isoforms，大大增加了基因組蛋白編碼的潛能。

同一個gene產(chǎn)生的可變剪切是大大的不同的，有時甚至會起到相反的效應。

為了研究基因表達，學者們往往使用二代技術，測得的是一些片段，也是就RNA-seq技術。然而，短的RNA-seq 不能跨越全長的轉錄本，也就不能精準的描繪出 isoform 的不同特性。

三代的核心優(yōu)勢：

Produce full-length transcripts without assembly（不用組裝）

The isoform sequencing (Iso-Seq) application generates full-length cDNA sequences — from the 5’ end of transcripts to the poly-A tail — eliminating the need for transcriptome reconstruction using isoform-inference algorithms.

The Iso-Seq method generates accurate information about alternatively spliced exons and transcriptional start sites.

It also delivers information about poly-adenylation sites for transcripts up to 10 kb in length across the full complement of isoforms within targeted genes or the entire transcriptome.

實操：Iso-Seq學習

文章解讀：Pacbio Iso-Seq 助力玉米高粱轉錄組研究

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案例：Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis

2015年發(fā)的The Plant Journal，IF=5.468，丹參不同根組織和丹參酮的生物合成（全長轉錄組測序和混合測序平臺來發(fā)現(xiàn)剪切變異體）

做了什么工作：

摘要：丹參是中國傳統(tǒng)藥材，它的根莖和根有很高的價值。它對應的生物活性成分是丹參酮，所以研究丹參酮的生物合成非常有價值，先前的轉錄組研究是基于NGS的，但是大部分的結果的 isotig 都不能代表全長的 cDNA 序列。而且這些研究都集中于整個植株和發(fā)狀根培養(yǎng)物。這里，我們證實了丹參酮色素是在根周皮中產(chǎn)生的，我們聯(lián)合應用了NGS和SMRT技術在不同的根組織中，特別是在根的周皮，來提供一個完整的丹參的轉錄組信息，而且進一步深入分析了丹參酮的生物合成。此外，使用SMRT測序，能夠檢測可變剪切，這里我們發(fā)現(xiàn)了檢測到的基因座中有40%的都發(fā)生了可變剪切，包括一些類異戊二烯和類萜代謝。

研究材料：丹參酮一般認為產(chǎn)生于丹參根部周皮部，研究分別取了根部的周皮（periderm）、韌皮（phloem）、木質（xylem）3種類型的根部組織進行了mRNA測序。（很常規(guī)的思路，分析重點落在特色作物的重要功能成分上，找到該功能成分的合成場所，對該部分組織進行轉錄組分析，通過分析就肯定能找到與該代謝物相關的差異表達基因，最后把其他代謝扯一扯就發(fā)了一篇文章）
研究方法：3種類型根部樣本各設置3個生物學重復，總共9個樣本，采用Hiseq2500 PE100進行測序，每個樣本產(chǎn)生~5G raw data 。9個樣本混合測序，采用PacBio進行測序，建<1kb、1-2kb、2-3kb、>3kb 四個SMRT bell文庫，總共產(chǎn)生~4.8G raw data（估計一下，這個項目花了多少錢呢？一個樣本Hiseq轉錄組多少錢？一個PacBio轉錄組多少錢？）

主要發(fā)現(xiàn)
1)采用Hiseq2500 數(shù)據(jù)對PacBio RSII平臺所產(chǎn)生的subreads進行了校正，最后得到了16,241個高質量非冗余isoform。
2)基于Hiseq2500產(chǎn)生的mRNA數(shù)據(jù)的差異表達分析，發(fā)現(xiàn)了在根部周皮部特異表達與者高表達丹參酮合成相關基因，SmCPS1、SmKSL1、GGPS、IPI、CYP等；
3) 最后研究者使用得到的16,241個高質量的Isoform進行了可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)了大約有40%檢測基因位點發(fā)生了可變剪接現(xiàn)象，其中有些基因參與了萜類化合物代謝及類異戊二烯代謝。

 

文章邏輯：

全文都圍繞著一個話題：tanshinone biosynthesis（丹參酮的生物合成）

引言怎么寫：

作物特點、價值、功效，核心功能成分的代謝途徑，揭示其機制非常重要。

前人在該方向上（轉錄組）的研究方法及結果：inducible diterpene synthases（誘導二萜合成酶），SmCPS1 and SmKSL1；cytochrome P450 (CYP)。主要集中于 tanshinone biosynthesis 的前提和關鍵步驟，二萜烯烴前體，最初的羥基化，牽扯到一些生物化學代謝途徑的解析。

本文使用技術的優(yōu)勢，目的及意義：1.全長轉錄組；2.dissect the root finely enough to localize tanshinone production and accumulation。

 

分析邏輯（結果）：

tanshinone積累的定位

這部分雖然簡單，但是可以顯著提升文章前后的邏輯性。 分離拍照，然后電鏡一張，UPLC成分含量分析。

Combined sequencing approach to the roots of danshen

這一步就是為了找出不同組織中的差異表達基因，使用NGS和SMRT混合測序手段，分析表達的基因。

Expression analysis indicates co-localization of tanshinone biosynthesis and accumulation

表達分析揭示tanshinone 生物合成和積累的協(xié)同定位

Co-expression analysis for the investigation of tanshinone biosynthesis

共表達分析

Alternatively spliced isoforms

可變剪切體

 

待續(xù)~

總結

以上是生活随笔為你收集整理的PacBio三代全长转录组/Iso-Seq技术及案例分析的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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