一、新冠病毒簡介

? ? ?2019新型冠狀病毒（2019-nCoV，世衛組織2020年1月命名；SARS-CoV-2，國際病毒分類委員會2020年2月11日命名）簡稱“新冠”。

??????? 冠狀病毒是一個大型病毒家族，已知可引起感冒及中東呼吸綜合征（MERS）和嚴重急性呼吸綜合征（SARS）等較嚴重疾病。新型冠狀病毒是以前從未在人體中發現的冠狀病毒新毒株。

? ? ? 2021年1月15日，英國已發現了一種來自巴西的變種新冠病毒?。2月21日，據俄羅斯報道，在印度各地發現了多達240種新冠病毒毒株的新型變種?。3月30日，中國—世衛組織新冠病毒溯源聯合研究報告在日內瓦發布，報告顯示，武漢華南海鮮市場不是新冠病毒最初來源地。.......此處省略一萬字，可自行百度。

二、新冠病毒檢測的本質

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? ? ? 核酸（DNA或者RNA）是生物體的遺傳物質，具有較好的保守性、完整性和儲存遺傳信息的功能。因此可以通過檢測樣本的核酸來判斷是否有新冠。核酸我們大家都知道是由AGCT(或者AGCU)組成，每個位置有4種可能的堿基，可以是AGCT中的任何一位。假設一個物種有100個核酸堿基組成，那么至少有4的100次方的序列可能，這已經是天文數字了。然而真實的新冠病毒有29763bp，如果隨機突變的話有4*29763次方的組合排列，每一種排列都可能產生一種新的序列信息，因此如果想要通過檢測核酸去針對的檢測相應的新冠毒株是比較困難的。我們必須盡可能多的找到相應毒株的核酸序列，從中找到相應株中都存在的保守序列，同時在其他株中不出現，方能完成特異性檢測。

三、新冠病毒檢測技術——熒光定量PCR

? ? ? 實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量,通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據,下圖為qpcr反應及檢測過程示意圖:

? ? ?通常qpcr設計引物長度在18-30bp之間，擴增片段在75-250bp之間。qpcr過程擴增產物短，擴增特異性強、效率高，能極大擴增病毒核酸信號，核酸檢測在新冠流行期間發揮了重要的防疫作用。

四、新冠變異株核酸序列準備

? ? ? 第一步找到NCBI上的新冠數據庫：

? ? ? ?第二步篩選新冠變異株序列并下載：

新冠變異株	Alpha	Beta	Delta	Gamma	普通株
Pango lineage	B.1.1.7	B.1.351	P.1	B.1.617.2	-

? ? ? ? 通過Pango lineage號我們能迅速的找到新冠常見的四種變異株，為了我們后期的算法方便，也為了進一步對數據進行高質量過濾簡化處理，我們可以通過下面三個參數進行篩選:第一個為特殊符號，測序過程對于測序堿基不能確定的會以N表示，我們選擇特殊符號為0，那么表示本次篩選到的是高質量的測序結果;第二個為基因組的完整度，我們選擇complete，表示完全匹配，測序深度很高，和參考基因組無縫拼接;第三個為Pango lineage，我們就不用多講了，想要哪個變異株就輸入哪個號。

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?????? 下載后的新冠阿爾法毒株有上萬條序列，每一條序列表示一個完整新冠基因組，總大小有1.9G的數據量。貝塔株較小有7.6M，德爾塔有將近70M，伽馬有115M的數據量，這些數據量的處理最好需要適合生物信息學的高配置電腦去處理。

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?五、設計原理分析

Alpha：α1，α2，α3，......αn

Beta：β1，β2，β3，......βn

Delta：δ1，δ2，δ3，......δn

Gamma：γ1，γ2，γ3，......γn

Normal：Alpha，Beta，Delta，Gamma 和其他株

? ? ? ?如上，下載后的序列中，包含NCBI上已經審核提交的所有的完整的相應株的序列。假如你要設計pcr的引物長度為20bp，首先從Alpha開始，你設計的5‘端和3’端引物必須同時出現在Alpha株中所有的其他序列中。有人會問為什么同是阿爾法的病毒不同序列會不一樣，他們不都是阿爾法株嗎？也就是說α1不完全等于α2，α2不完全等于α3，以此類推，有可能在所有的α中，沒有任何兩個是完全一樣的，理論上可能出現這種情況，正如同上面我們說到的新冠檢測本質一樣，其堿基基數太大，而SNP(也叫單核苷酸突變位點)是很容易在培養的病毒或者流行的病毒中發現的。我們知道新冠為單鏈RNA病毒，單鏈相比于雙鏈更加容易發生堿基突變，但這并不妨礙變異株還是新冠病毒的事實，因為只有當突變到達一定的比例之后才能定義為新物種。言歸正傳，當序列滿足同時出現在所有的阿爾法株時，還需要滿足其特異性檢測，也就是其引物一定不能出現在貝塔、德爾塔、伽馬中。對于貝塔、德爾塔、伽馬的引物設計如同阿爾法毒株引物設計思路。

? ? ? ?下一步就是如何實現上面的思路，qpcr擴增的酶具有高保真性，也就是說當引物序列和待檢測的樣本核酸序列完全匹配時才能進行擴增。因此我們所涉及的序列是具有特異性、唯一性。我們借鑒宏基因組測序分析方法——kermer，通過20bp的kermer，我們可以將一條序列全部截成長度為20bp的連續序列，如我們的序列長度29763bp，則可以生產29763-20+1=29744條長度為20bp的堿基集。

? ? ? ?好了，今天先講到這里，歡迎訂閱下期文章。順便再做下推廣：新的宏基因組在線分析網站地址為：www.xiaohongwgsa.top，感興趣的可以查看！歡迎掃碼定期訂閱相關文章！

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總結

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