转录组分析综述A survey of best practices for RNA-seq data analysis
轉(zhuǎn)錄組分析綜述
- 轉(zhuǎn)錄組 ?
- 文獻(xiàn)解讀 ?
- Trinity ?
- cufflinks
今天介紹下小編最近閱讀的關(guān)于RNA-seq分析的文章，文章發(fā)在Genome Biology 上的A survey of best practices for RNA-seq data analysis 。由于文章較長(zhǎng)和枯燥，小編認(rèn)為重要的信息，已經(jīng)加粗加紅，可以直接看重要信息。不要問我為啥這么好，請(qǐng)叫我雷鋒。
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摘要?
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現(xiàn)在RNA-seq數(shù)據(jù)使用廣泛，但是沒有一套流程可以解決所有的問題。我們重點(diǎn)關(guān)注RNA-seq分析中的重要的幾步：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，質(zhì)控，read比對(duì)，表達(dá)定量，可視化，差異表達(dá)，識(shí)別可變剪切，功能注釋，融合基因檢測(cè)，eQTL定位等。
文章會(huì)討論每一步分析中的重點(diǎn)和面臨的問題，另外最后說明了RNA-seq如何和其他數(shù)據(jù)相結(jié)合分析的。
背景
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利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來識(shí)別轉(zhuǎn)錄本和表達(dá)定量，是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的核心作用。由于這個(gè)作用，他可以不依賴其他組學(xué)信息，單獨(dú)成為一個(gè)產(chǎn)品項(xiàng)目RNA-seq 測(cè)序。所以導(dǎo)致RNA-seq 徹底的火了起來。這之后出現(xiàn)了很多的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和分析文檔。這使得新的用戶為了做好實(shí)驗(yàn)，不得不去認(rèn)識(shí)和理解所有的實(shí)驗(yàn)步驟。
目前的情況是沒有一成不變的流程，整個(gè)分析過程都是根據(jù)不同的物種，不同的設(shè)計(jì)目的進(jìn)行變化的。本文中我們只關(guān)注常規(guī)RNA-seq分析。也就是摘要中主要說的那幾部分。
同時(shí)，文章指出在流程的整個(gè)過程中都應(yīng)該添加check point ?以期得到好的結(jié)果。?
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
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想要獲得感興趣的生物學(xué)答案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一定要合理。首先要對(duì)數(shù)據(jù)的建庫類型，測(cè)序深度和生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行選擇。另外就是保證測(cè)序機(jī)器運(yùn)行充分，盡量少的產(chǎn)生無效數(shù)據(jù)。
這里我們知道對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序存在兩種方法：檢測(cè)polyA和核糖體剔除。對(duì)于真核而言，通常利用第一種方法，而對(duì)于細(xì)菌，沒有polyA，應(yīng)該用第二種。
文中指出轉(zhuǎn)錄組也應(yīng)該多測(cè)些長(zhǎng)片段，這可以提供比對(duì)效率和轉(zhuǎn)錄本識(shí)別能力。利用那種數(shù)據(jù)取決與分析的目的。如果研究的物種是注釋非常好的，只是來研究其表達(dá)水平，利用便宜和短的se就夠啦。但是如果注釋的不好的話，pe和長(zhǎng)read 能發(fā)揮好的作用。
對(duì)于測(cè)序深度，取決于轉(zhuǎn)錄本的復(fù)雜程度，太低和太高都不好。
關(guān)于重復(fù)，應(yīng)該是包括技術(shù)導(dǎo)致的重復(fù)，這個(gè)很難處理掉，只能在實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，多加小心，盡量避免。而對(duì)于人為設(shè)定的生物學(xué)重復(fù)，利用利用統(tǒng)計(jì)學(xué)工具進(jìn)行過濾。
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在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，如果樣品太多，應(yīng)該按照組別進(jìn)行處理。這樣可以減少錯(cuò)誤。
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2、RNA-seq分析
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RNA-seq文庫制備過程包括：RNA fragmentation, cDNA synthesis, adapter
ligation, PCR amplification, bar-coding, and lane loading)。這里要注意數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，文庫大小標(biāo)準(zhǔn)化，縮小堿基偏好性： such as the use of adapters with random nucleotides at the extremities or the use of chemical-based
fragmentation instead of RNase III-based fragmentation.?
如果樣品太多，不得不用分開測(cè)序，或者在不同的lane上，一定要對(duì)batch effect?進(jìn)行處理，以防其他因素影響實(shí)驗(yàn)。
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(1)質(zhì)控點(diǎn)
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<1>、原始數(shù)據(jù)
包括GC含量，數(shù)據(jù)質(zhì)量，有無接頭，復(fù)制比例等。這里同一個(gè)物種的樣品測(cè)序的數(shù)據(jù)中信息應(yīng)該是一致的。如果相差超過30%，應(yīng)該被去掉。
這里監(jiān)控的軟件推薦fastqc和NGSqc。另外read兩端的數(shù)據(jù)如果質(zhì)量很低，應(yīng)該被切掉，這里推薦工具：FASTX-toolkit和Trimmomatic。
<2>、read 比對(duì)
一個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)是read比對(duì)效率。
文章測(cè)試中70-90%的read比對(duì)上了人的基因組。
另外一個(gè)是uniformity of read coverage on exons and the mapped strand.在利用polyA選擇進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中如果read富集在3端，可能預(yù)示數(shù)據(jù)質(zhì)量過低。
還有就是GC含量評(píng)估了堿基的偏好性。推薦的軟件：RSeQC、Qualimap。
<3>、表達(dá)定量
檢測(cè)GC含量和基因長(zhǎng)度的偏好，這樣可以更好的進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，推薦的軟件
NOIseq EDASEQ。
<4>、生物學(xué)再現(xiàn)
這里要對(duì)樣品相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估，比對(duì)spearman R2 >0.9。同時(shí)一定要對(duì)batch effect?進(jìn)行評(píng)估和過濾。這里主要可以利用PCA進(jìn)行分析。（詳情見上一篇文章）
<5>、轉(zhuǎn)錄本識(shí)別
如果有參考，直接比對(duì)就可以啦，當(dāng)時(shí)如果沒有參考，這里首先愛你需要進(jìn)行組裝，然后定進(jìn)行表達(dá)定量。這里建立用來組裝的和定量的數(shù)據(jù)要有從繼性和同步性。
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（2）、比對(duì)
（3-1）、轉(zhuǎn)錄本識(shí)別
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有參考的情況下，對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行識(shí)別這里用到的軟件根據(jù)不同的情況有以下幾個(gè)：GRIT、Cufflinks、StringTie、Augustus（輔助基因預(yù)測(cè)）等
利用短的序列其實(shí)是很難得到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的，同時(shí)起始和結(jié)尾預(yù)測(cè)也不準(zhǔn)確。
（3-2）、從頭組裝
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如果沒有參考，或者參考比較糟糕，我們需要自己從頭組裝。主要的軟件：SOAPdenovo-Trans [30], Oases [31], Trans-ABySS [32] or Trinity [33].對(duì)與低表達(dá)的區(qū)域，覆蓋太低，很難組裝出來，read覆蓋過高，又容易組裝錯(cuò)誤。這里建議如果存在多個(gè)樣品的時(shí)候，建議進(jìn)行混樣組裝。
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（4）、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量
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通常都是通過read比對(duì)來做，也有通過kmer做的?？梢岳胷aw counts of mapped read 進(jìn)行評(píng)估，但是這個(gè)指標(biāo)沒有考慮基因的長(zhǎng)度和其他的因素。RPKM是一個(gè)去除了基因長(zhǎng)度和文庫影響的組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化的指標(biāo)，同樣的指標(biāo)還有FPKM，RPKs，TPM等。主要的軟件：Cufflinks,RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) , eXpress , Sailfish and kallisto?
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（5）、差異表達(dá)分析
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常用的軟件有很多，在使用的使用要注意每種軟件使用的數(shù)據(jù)分布特征。
同樣這里很重要的是一定要對(duì)batch effect進(jìn)行評(píng)估和過濾（COMBAT
）目前鮮有軟件對(duì)于不同的數(shù)據(jù)都表現(xiàn)良好，因此建議對(duì)于重要的結(jié)果，利用多個(gè)軟件綜合進(jìn)行分析。
（6）、可變剪切分析
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方法1：transcript expression and total gene expression? rSeqDiff：uses a hierarchical likelihood ratio test to detect differential gene expressionwithout splicing change and differential isoform expression simultaneously 方法2： exon-based? approach ? detects signals of alternative splicing by comparing the distributions of reads on exons and junctions of the genes between the compared samples；
（7）、可視化
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用戶需要通過可視化看到read覆蓋在基因上的變化，以此來對(duì)結(jié)果魯棒性進(jìn)行評(píng)估。
推薦的軟件：UCSC browser、Integrative Genomics Viewer (IGV)、Genome Maps、Savant 、RNAseqViewer等。
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另外文章還介紹了融合基因檢測(cè)，sRNA和功能注釋等。
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然后文章探究了RNA-seq和其他數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)合分析，包括基因組數(shù)據(jù)，甲基因數(shù)據(jù)，Chromatin features、MicroRNAs、Proteomics and metabolomics等。
最后文章對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)和三代測(cè)序進(jìn)行對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的影響進(jìn)行了說明：
single cell studies are meaningful only when a set of individual cell libraries are compared with the cell population, with the aim of identifying subgroups of multiple cells with distinct combinations of expressed genes ? Long-read sequencing provides amplification-free, singlemolecule sequencing of cDNAs that enables recovery of full-length transcripts without the need for an assembly step?
轉(zhuǎn)載于:https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9818990.html
總結(jié)
以上是生活随笔為你收集整理的转录组分析综述A survey of best practices for RNA-seq data analysis的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。
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