文章信息

題目：The MdBBX22–miR858–MdMYB9/11/12 module regulates proanthocyanidin biosynthesis in apple peel

刊名：Plant Biotechnology Journal

作者：Bo Zhang, Zheng-Yang Zhao et al.

單位：Northwest A&F University

First published: 08 May 2022?

摘要

1

原花青素 (PA) 具有抗氧化特性，對人體健康有益。蘋果 ( Malus ?×? domestica Borkh.) 的果實，尤其是果皮，富含多種類黃酮，如 PAs，是膳食抗氧化劑的重要來源。以往對蘋果PAs調控的研究主要集中在轉錄水平，而在轉錄后水平的研究相對較少。在本研究中，研究了蘋果果皮中 mdm-miR858（一種在植物發育中具有多種功能的 miRNA）的功能。研究者發現 mdm-miR858 通過靶向MdMYB9 / 11 / 12負調控 PA在果皮中積累。在果實發育過程中，mdm-miR858表達與MdMYB9 / 11 / 12表達和PA積累呈負相關。5'-RACE 實驗、GUS 染色測定和瞬時熒光測定表明 mdm-miR858 切割并抑制MdMYB9 / 11 / 12的表達。蘋果愈傷組織、煙草和擬南芥中 mdm-miR858 的過表達減少了由MdMYB9 / 11 / 12過表達誘導的 PA 的積累。此外，研究者發現 MdBBX22 與 mdm-miR858 啟動子結合并誘導其表達。MdBBX22的過表達誘導mdm-miR858的表達抑制過表達MdMYB9 / 11 / 12的蘋果愈傷組織中PAs的積累。在光脅迫下，MdBBX22 誘導 mdm-miR858 表達以抑制 PA 積累，從而間接增強果皮中花青素的合成。目前的結果表明，MdBBX22–miR858– MdMYB9 / 11 / 12模塊調節蘋果中 PA 的積累。該研究結果為進一步研究PA積累的調控機制以及PAs與花青素的關系提供了參考。

技術路線

2

主要結果

3

3.1?蘋果皮發育過程中mdm-miR858的表達與PA積累呈負相關

在蘋果'Starkrimson Delicious'果實的果皮發育過程中，兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2和總PAs的含量在開花后30至60天（DAFB）迅速下降，從60至90 DAFB略有增加，隨后下降。（圖?1a,b）。

為了鑒定參與調節 PA 積累的 miRNA，在 30、60、90、120 和 140 DAFB 收集蘋果皮樣品并用于 sRNA 測序。總共鑒定了 5106 個獨特的成熟 miRNA。所有 miRNA 分為三組：已知 miRNA (617)、保守 miRNA (60) 和新 miRNA (4429)。對這些 miRNA 的表達與總 PA 含量進行了相關性分析。188 種 miRNA（39 種已知 miRNA、7 種保守 miRNA 和 142 種新 miRNA）的表達與 PA 含量呈負相關（圖?1c）。對其靶基因的預測顯示，只有mdm-miR858、MdMYB9的預測靶基因/11 / 12，參與類黃酮生物合成。基于 sRNA 測序數據的 mdm-miR858 的表達模式通過 qRT-PCR 分析的結果得到驗證（圖?1d，e）。這些結果表明mdm-miR858可能參與了PA積累的調節。

3.2?mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12抑制蘋果愈傷組織中 PA 的積累

研究者使蘋果皮和蘋果愈傷組織中的?MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12沉默。沉默MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12分別降低了蘋果皮和蘋果愈傷組織中的總 PA 含量；然而，當MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12同時沉默時，總 PA 含量下降更顯著。這些結果表明 MdMYB9、MdMYB11 和 MdMYB12 在調節 PA 方面具有功能冗余。為了驗證 mdm-miR858 抑制 PA 積累，產生了 MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 的過表達愈傷組織。在用 4-二甲氨基肉桂醛 (DMACA) 染色后，MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 愈傷組織被染成紫色（圖?4a）。定量逆轉錄 PCR (RT-qPCR) 分析顯示MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12在MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12中的表達與野生型愈傷組織相比，-OX愈傷組織顯著增加（圖?4b）。HPLC分析表明，MdMYB9-OX、MdMYB11-OX和MdMYB12-OX愈傷組織中兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2和總PAs的含量高于野生型愈傷組織（圖?4c）。當 mdm-miR858 在MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 愈傷組織中過表達時，MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12在 mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm- miR858-OX/ MdMYB11中的表達水平顯著降低（圖?4b）。用 DMACA 染色后，mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm-miR858-OX/MdMYB11-OX 和mdm -miR858-OX/ MdMYB12 -OX愈傷組織中不存在紫色（圖?4a）。與MdMYB9- OX、MdMYB11- OX和MdMYB12- OX愈傷組織相比，兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2和總PA含量顯著降低（圖?4c）。

3.3?MdBBX22誘導mdm-miR858的表達抑制PA積累并改變代謝過程以增強光脅迫下蘋果皮中花青素的合成

MdBBX22 是蘋果中的一種光響應轉錄因子。這使我們推測 MdBBX22 可能調節 mdm-miR858 的表達，從而影響光脅迫下的 PA 積累。首先，蘋果果實在 45 DAFB 時被裝袋，在 120 DFAB 時，水果被打開并放置在光照培養箱中暴露在連續光照下。光脅迫下總 PA 含量降低，而花青素含量增加（圖?8a）。RT-qPCR 分析顯示MdBBX22和mdm-miR858的表達在光脅迫下增加，而MdMYB11和MdMYB12的表達在光脅迫下減少（圖?8b），并且MdMYB9總是表現出低表達水平。這些結果表明，MdBBX22可能通過在光脅迫下上調mdm-miR858的表達參與PA的調節。

為了驗證 MdBBX22 可以誘導 mdm-miR858 的表達以抑制光脅迫下蘋果皮中 PA 的積累，我們在蘋果皮中通過瞬時轉化，過表達了 MdBBX22 、MdBBX22 （圖8c），MdBBX22 -OX 蘋果皮?中的花青素含量增加（圖8d，f），而MdMYB11和MdMYB12的過表達系中總 PAs 的含量降低（圖?8e，f），而MdMYB11和MdMYB12的過表達體總 PA 的含量增加（圖?8e，f）。這些結果表明 MdBBX22 誘導 mdm-miR858 的表達以抑制光脅迫下蘋果皮中 PA 的積累。

3.4 mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12抑制煙草和擬南芥中 PA 積累

為了驗證 mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12以抑制 PA 積累，研究者在煙草和擬南芥中過表達MdMYB9 / 11 / 12。mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm-miR858-OX/ MdMYB11 -OX和mdm-miR858-OX/ MdMYB12 -OX煙草花中花青素含量增加。然而，兒茶素、表兒茶素和總 PA 的含量下降，而其他黃酮醇的含量保持不變。

當將MdMYB9 / 11 / 12轉移到擬南芥tt2突變體中時，種皮的顏色變為棕色，并且 DMACA 將種皮染色為藍黑色（圖?5a）。MdMYB9- OX/ tt2、MdMYB11 -OX/種子中PA含量及MdMYB9、MdMYB11、MdMYB12的相對表達量與tt2突變體相比，tt2和MdMYB12 -OX/ tt2擬南芥顯著增加（圖?5b，c）。當mdm-miR858轉化為MdMYB9 - OX/ tt2、MdMYB11 -OX/ tt2和MdMYB12 - OX/ tt2擬南芥時，mdm-MIR858（pre-mdm-miR858）和mdm-miR858大量表達（圖?5c)，種皮是淺黃色并且沒有被DMACA染色(圖?5a )。總PAs含量及MdMYB9 / 11/ 12在種子中顯著減少（圖?5b，c）。此外，與擬南芥MdMYB9-OX/ tt2、MdMYB11- OX/ tt2和MdMYB12 -OX/ tt2相比， AtDFR、AtANS和AtANR的表達顯著降低（圖?5d）。

結論

4

總之，本研究表明，mdm-miR858可以靶向MdMYB9 / 11 / 12從而抑制PAs的積累。在光脅迫下，MdBBX22與mdm-miR858啟動子結合，通過靶向MdMYB9 / 11 / 12誘導mdm-miR858表達抑制PA積累，抑制PA分支促進蘋果果皮中花青素的快速合成。研究結果揭示了轉錄后水平上 PA 合成的新調控機制。此外，本研究結果闡明了輕脅迫下蘋果皮中 PAs 和花青素之間的關系。

獲取原文

5

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13839

補充材料：

https://onlinelibrary.wiley.com/action/downloadSupplement?doi=10.1111%2Fpbi.13839&file=pbi13839-sup-0001-FigureS1-S14.pdf

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